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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
 Inserito il - 19 marzo 2007 : 22:51:05
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Dopo un bel pò di tempo passato nel felice mondo di coli sono tornato alle gioie del cell culture...
il mio problema è che dopo aver trasfettato in CHO dovrei scegliere il miglior clone a livello di produzione di proteina...
Dato che l'idea piastrare in limiting tante, ma tante, piaste per poi screenarle non mi solletica affatto avevo pensato "sortare" le mie celluline col FACS, quanto meno per ottenere un arricchimento di high-porducer nella popolazione cellulare.
Il problema è che col FACS non si lavora in condizioni di sterilità, quindi rischierei di contaminare le mie cellule...ora, io il rischio lo prenderei pure, tanto male che va butto via una flask, tanto per provare, no?
Pensavo di fare un ciclo di lavaggio dei tubi con l'ipoclorito (che dovrebbe essere normale per il FACS, giusto?) eppoi dopo aver sortato le cells aggiungere qualche bel cocktail di antibatterici/micotici...
Dopotutto se riescono ad isolare e metter in coltura sterile cellule da colon...
Qualsivoglia suggerimento, commento, critica and so on sono bene accetti!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2007 : 00:34:35
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Guarda, io faccio colture primarie e tutta la prima parte del mio protocollo (cioè fino alla dissociazione delle cellule) la faccio in ambiente non sterile e non ho mai avuto problemi di contaminazione.
Certo se eviti di sputacchiare sulle piastre è meglio :)
Io direi: prova e al max butti via il tutto!
E ovviamente consiglierei di risciacquare ampiamente il tutto con H2O milliQ sterile dopo che hai usato l'ipoclorito... ma se quella è pratica normale con il FACS credo sia normale anche il risciacquo (mai usato un FACS)
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2007 : 18:38:49
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| metto "solo" pen/strep + g418(il marker di selezione) o posso aggiungere qualche altra schifezza? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2007 : 22:20:36
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| Io uso solo pen/strep ma le CHO penso non abbiano problemi a sopravvivere anche se ci sbatti dentro qualche antifungino. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2007 : 14:20:35
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Benvenuto nel mondo dei cloni stabili, io ci sto dietro da mesi e me li sto
screenando uno ad uno: uno sporco lavoro ma qualcuno dovrà pure...
Il mio consiglio è : evita qualsiasi procedimento che porti ad un
aumento del rischio di contaminazione. Questo tipo di lavoro comporta
già di per sè un'alta probabilità di 'incidenti' (ne so qualcosa...)
per cui fossi in te, ipoclorito o no, non tirerei troppo la corda.
Sottolineo: io lavoro COSTANTEMENTE in Pen/strep e G418 (1 mg/ml!!!!)
eppure sono in perenne guerra con saccaromices. Fai tu. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2007 : 20:21:53
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Dionysos, grazie del consiglio, ma permettimi una domanda: qualcuno lavora con lieviti dalle tue parti?
Anzi due: anche qualcuno fa il pane e/o la pizza a casa?
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2007 : 20:45:19
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ahah no nessuna di queste cose, però nella nostra sezione le contaminazioni da lievito
sono abbastanza frequenti e basta una svista, specialmente quando si fa un lavoro così
delicato (p.es. tenere una stessa piastra in selezione per 3 settimane, con almeno dieci
cambi di terreno). Io la proposta di comprare un antifungino l'ho fatta, ma il 'boss'
insiste gnuccamente sul fatto che costano una cifra e sono eucariotossici. mah.
Ier l'altro ho piccato 72 cloni (in tre multiwell da 24) e il giorno dopo
mi son trovato 2 wells contaminati. Ti auguro una sorte migliore. 
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2007 : 21:04:00
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fino ad ora, facendo corna, non ho mai neanche visto una contaminazione da lievito...
però mi hanno detto che capita spesso con persone a cui piace impastare... magari c'è qualche altro user della cappa? Da dove sbuca fuori sennò?
perdona la mia solita curiosità patologica! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2007 : 21:26:08
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Ce li hai pure in bocca e sulle mani/braccia dopo pranzo, no? 
Si poggiano sopra/sotto le piastre e nell'incubatore crescono a dismisura..
..fai conto che ogni Petri potrebbe essere rivestita da microorganismi d'ogni tipo. |
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kia35
Nuovo Arrivato
Prov.: Varese
Città: Barasso
15 Messaggi |
Inserito il - 28 agosto 2007 : 23:10:26
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Ciao a tutti! dopo qualche mese che avete scritto questo post, mi sono accorta che mi coinvolge in prima persona.-)
Io sto facendo dei trasfettanti stabili di cellule Jurkat che esprimono la proteina di fusione GFP-CIITA...ok fin qui tutto tranquillo....i problemi sono nati nel momento in cui le mie belle celluline sono cresciute nel terreno selettivo (G418 1.5mg/ml) e analizzandole al FACS mi sono accorta che la GFP era ben spressa ( alta % di cellule verdi e alta fluorescenza) ma in meno di 1 settimana si perdeva quasi completamente l'espressione..ok, allora armata di tanta pazienza e coraggio mi sono messa a fare limiting dilutions di sti trasfettanti, nella speranza di potermi isolare una sotto-popolazione di Jurkat che esprimessero bene e STABILMENTE il GFP-CIITA...ok...io e la mia capa (che mi sta tuttora frustando x continuare) abiamo iniziato questo lavoro ad aprile e, dopo 6 clonaggi
o piu nn abbiamo ancora ottenuto niente di stabile..
naturalmente non abbiamo la possibilità di usare un sorter.. 
A qualcuno è mai capitato di perdere l'espressione della GFP in cosi pochi giorni? ( ex. dal 90% di cell fluorescenti al 5% in 5 giorni)...avete suggerimenti... AIUTOOOO, vedo cloni ovunque!!!!! |
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kia35
Nuovo Arrivato
Prov.: Varese
Città: Barasso
15 Messaggi |
Inserito il - 28 agosto 2007 : 23:13:06
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| ah..ovviamente, grazie a chiunque legga o risponda !! |
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Cell Sorting e Sterilità
Didattica e Relazioni
