| Autore |
Discussione |
|
|
Francesco Zorutti
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 21 settembre 2015 : 23:36:49
|
Buonasera a tutti!
Sono nuovo di questo forum e voglio porvi un quesito su una questione che mi assilla ormai da tempo.
Parliamo di Elettroforesi di DNA su gel d'agoraio.
Dispongo di una PCR per amplificare il DNA, ma non di una cella elettroforetica che ho dovuto costruire da solo. La cella è costituita da una vaschetta ai lati della quale sono disposti due elettrodi di grafite (sono mine per matite). Le mine sono collegate ad un alimentatore per stampanti da 32 Volt. Il gel è costituito da TAE e anche la soluzione in cui lo immergo è TAE.
Tuttavia la cella non funziona.
Spiego il procedimento che faccio:
Preparo il gel e lo verso nella cella, aspetto che solidifichi e rimuovo il gel presente in corrispondenza degli elettrodi con un coltello, stacco il pettine, ricopro il tutto con tampone fresco, carico i pozzetti con i campioni e il Blu di Bromofenolo, faccio partire la corrente e tutto sembra funzionare. Dopo una decina di minuti il tutto si arresta e la corrente sembra non fluire più (le bolle sugli elettrodi diminuiscono sempre di più fino ad essere quasi assenti).
Qualcuno può aiutarmi? come è possibile che la corrente smetta di fluire?
Un grazie in anticipo a chiunque vorrà aiutarmi!
|
|
|
|
|
Francesco Zorutti
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2015 : 01:16:48
|
| Nessuno vuole aiutarmi? |
 |
|
|
Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
 Inserito il - 24 settembre 2015 : 09:04:37
|
 Scritto da MolecularLab Mobile
Confido nelle tue capacitá da elettricista amatoriale! Cmq a quanto ho capito tu versi il gel direttamente nella cella di corsa?? E poi rimuovi la parte in eccesso dagli elettrodi? Bhe in quel caso ti conviene versartelo in un altra vaschetta il gel e poi trasferirlo magari tagliandolo nella cella di corsa giá piena col TAE. Considera che per far avvenire la corsa non hai bisogno che il gel occupi completamente lo spazio tra i due elettrodi e nemmeno tutta l'ampiezza orizzontale della cella di corsa! Prova! |
|
|
|
|
Francesco Zorutti
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2015 : 22:25:51
|
Innanzitutto grazie per avermi risposto !
Purtroppo non funziona neanche così, quello che non riesco a capire è: perché il catodo (+) si distrugge nonostante la grafite sia un materiale inerte? |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2015 : 14:52:51
|
Premettendo che non so nulla di elettricità e che non sarei certamente in grado di costruirmi una celletta elettroforetica da sola.
Quello che mi viene in mente però è che man mano che il gel migra, la resistenza aumenta e magari il voltaggio (che non è elevato, hai detto che sono 32 Volt) non è sufficiente a permettere la corsa e tutto si blocca. |
|
|
|
Francesco Zorutti
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2015 : 10:55:22
|
Grazie anche a te per la risposta GFPina!
Al fatto che il voltaggio non è elevato ci ho pensato anche io, ma guarda su questo protocollo che ti allego: fanno l'elettroforesi di DNA con soli 27 Volt...
Allegato:  web_cella_elettroforeticays.pdf
272,52 KB |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2015 : 00:13:26
|
Sì a 30V (27 o 32 cambia poco) l'elettroforesi del DNA viene tranquillamente, anche se il gel migra lentamente. Anche con le cellette acquistate e con relativo alimentatore mi è capitato di farne a quei voltaggi.
Però il fatto che man mano che la corsa procede aumenti la resistenza è un dato di fatto, e questo fa necessariamente diminuire la corrente.
Ora... non so molto dei dettagli tecnici, ma magari nel tuo sistema c'è qualche dispersione, o la grafite non funziona abbastanza bene come conduttore... non so. Ma da come lo descrivi sembra proprio un'interruzione di corrente dovuta all'aumentare della resistenza.
Su come agire sull'impianto elettrico della tua celletta, non saprei cosa dirti. Però magari prova in qualche modo a ridurre la resistenza e vedere se è quello il problema. Puoi provare a fare delle corse con gel meno concentrati e vedere se la migrazione va avanti per più tempo.
Un'altra cosa è, hai notato se la tue celletta si scalda molto? Anche questo fa diminuire la corrente e rallentare la corsa in genere. Puoi provare a mantenere il sistema più "freddo", prova ad usare tamponi tenuti in frigorifero o a mantenere il tuo sistema freddo con del ghiaccio intorno.
Non so sono solo delle idee, ma magari qualcosa funziona!
Facci sapere!  |
|
|
|
Francesco Zorutti
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2015 : 01:00:09
|
Dunque, sul fatto che il sistema si scaldi hai perfettamente ragione! Ora metto in freezer una vaschetta con dell'acqua così domani pongo la celletta direttamente sul ghiaccio durante la corsa!
Per l'aumento di resistenza non saprei proprio cosa fare... In teoria anche a 300 Volt la resistenza dovrebbe aumentare e impedire la corsa (in proporzione...) perché nei laboratori ciò non accade?
Ad ogni modo domani farò correre un gel allo 0.5% (non so cosa filtrerà ma proviamoci!)
Vi aggiorno! |
|
|
|
NASTA
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 02 ottobre 2015 : 13:37:23
|
| Novità? |
|
|
|
Uther
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Na
35 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2015 : 10:04:21
|
Ciao,
personalmente problemi del genere mi sono capitati mille volte e purtroppo con apparati acquistati.
L'ultima volta la presa di corrente dove era attaccato il power supply andò in massa, nessuno ci fece caso e per capire cosa era successo al gel ci scervellammo per giorni.
Questo per dirti che molto spesso anche se setti perfettamente tutte le condizioni è possibile che qualche cosa ti sfugga; quindi ti direi:
- controlla il buffer, se vecchio o riciclato la forza ionica può essere diversa da quella che ti aspetti e quindi si genera una corrente più bassa (=resistenza maggiore);
- quanto è grande l'apparato che hai costruito? se troppo grande potresti avere una produzione di calore che il sistema non sopporta;
- fisicamente come sono inseriti gli elettrodi? se uno dei due elettrodi è "lento" il circuito non si chiude in maniera efficiente e hai perdita di potenza;
- verifica prese di corrente e power;
- il gel se troppo concentrato potrebbe offrirti più resistenza, ma non tale da crearti problemi;
Fammi sapere quando sveli l'arcano ;)
Ut |
|
|
| |
Discussione |
|
Problema Elettroforesi
Siti Scientifici
