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janisfree
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
 Inserito il - 04 febbraio 2016 : 15:30:47
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Ciao a tutti,
avrei bisogno che qualcuno mi spiegasse il significato dei + e - che vengono posizionati al di sopra dei blot dell'IP.
E' una tecnica che non ho mai applicato, sto cercando di studiarne ora la teoria.
Grazie a chi saprā rispondermi :)
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SpemannOrganizer
Utente
Cittā: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2016 : 03:19:09
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I segni + e - indicano semplicemente se un reagente e' stato incluso (+) oppure no (-) nella reazione indicata. In particolare, qui viene mostrato un esperimento relativo a una immunoprecipitazione, una tecnica comunemente usata per verificare l'interazione fisica tra due o piu' proteine. I primi due blot, Flag/V5 e Myc fanno parte della IP stessa. Il terzo (input, Myc) indica il lisato prima della IP (1% si riferisce alla quantita' di lisato caricata su gel e analizzata) e viene usato come semplice controllo per mostrare che la proteina di interesse, taggata con Myc, e' correttamente espressa e quindi presente nelle varie condizioni sperimentali.
Le prime due lanes sono due semplici controlli che si fanno di solito quando fai una IP. In particolare nota che questa IP e' stata fatta usando un anticorpo specifico per Flag o V5. La prima lane e' relativa a un lisato di cellule (immagino) che sono state transfettate con il solo costrutto myc-parkin. Gli anticorpi Flag/V5 non legano con l'epitopo Myc, quindi tale proteina non viene precipitata (questo e' quindi un controllo negativo che ti assicura la specificita' del tuo anticorpo). La seconda lane e' un controllo positivo che mostra come la tua proteina Flag-paris venga immunoprecipitata efficacemente dall'anticorpo anti Flag. Cosa succede se metti Flag-Paris e Myc-Parkin insieme trasfettandoli nelle stesse cellule (nota i due + nella TERZA LANE)? l'anticorpo anti-Flag tirera giu' Paris, ma sicoome paris interagisce con parkin, anche parkin viene immunoprecipitato (nota il segnale nel blot Myc, relativo alla IP). Al contrario, XIAP non interagisce con Paris e quindi non viene co-immunoprecipitato (quarta lane). Nella quinta lane hai il risultato di una IP diversa, condotta con un anticorpo anti V5, che leghera' la proteina V5-ZNF398. Qui viene testato il legame tra detta proteina e Myc-Parkin. Siccome le due non interagiscono, myc-parkin non viene co-immunoprecipitato nella IP.
Spero di esserti stato utile.
Gabriele
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