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janisfree
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
 Inserito il - 16 febbraio 2017 : 16:41:07
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Ciao a tutti.
Sto cercando un protocollo valido per l'estrazione di proteine di cellule animali adese da una 6-wells plate usando direttamente il Laemmli.
Io sono abituata ad estrarre con RIPA buffer, ma ho scoperto che c'è questa alternativa.
Qualcuno me la potrebbe spiegare nel dettaglio? Grazie mille :)
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 18 febbraio 2017 : 17:31:01
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Mah...direi che metti una certa quantità di laemmli direttamente sulla piastra e screpi, poi centrifughi per eliminare le membrane.
Ma non puoi fare un dosaggio proteico, quindi non so quanto sia utile. |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2017 : 11:50:08
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| Si di solito il principale svantaggio è proprio che ottieni campioni non dosabili. Però se parti da un numero di cellule del tutto paragonabile tra i tuoi campioni puoi sperare di normalizzare il risultato con una proteina housekeeping se devi farci un western-blot (semplicemente usando lo stesso volume di Laemmli e caricando lo stesso volume nel gel). Il vantaggio è che si tratta di una lisi e estrazione immediata e piuttosto forte, quindi rischi meno che la tua proteina si degradi e solitamente ottieni estratti piuttosto concentrati. Di solito con questo metodo liso le cellule in Laemmli2x, e dopo aver recuperato il campione lo sonico brevemente per frammentare il DNA genomico che altrimenti ti rende impossibile un caricamento "pulito" sul gel. Poi solita bollitura a 95°C e centrifugata a massima velocità prima di caricare. |
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CrackTheBrain
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 15 aprile 2017 : 10:58:17
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 Scritto da MolecularLab Mobile
Ciao Geeko, una curiosità,come mai centrifughi prima di caricare? Hai notato dei miglioramenti facendolo? Perché io solitamente ometto il passaggio della centrifugazione e ottengo comunque campioni puliti in W.blot |
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Estrazione proteine con Laemmli
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