Estrazione proteine con Laemmli

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janisfree
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29 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2017 : 16:41:07

Ciao a tutti.

Sto cercando un protocollo valido per l'estrazione di proteine di cellule animali adese da una 6-wells plate usando direttamente il Laemmli.
Io sono abituata ad estrarre con RIPA buffer, ma ho scoperto che c'� questa alternativa.
Qualcuno me la potrebbe spiegare nel dettaglio? Grazie mille :)

domi84
Moderatore

Citt�: Glasgow

1724 Messaggi

Inserito il - 18 febbraio 2017 : 17:31:01

Mah...direi che metti una certa quantit� di laemmli direttamente sulla piastra e screpi, poi centrifughi per eliminare le membrane.
Ma non puoi fare un dosaggio proteico, quindi non so quanto sia utile.

Geeko
Utente

Citt�: Milano

1043 Messaggi

Inserito il - 19 febbraio 2017 : 11:50:08

Si di solito il principale svantaggio � proprio che ottieni campioni non dosabili. Per� se parti da un numero di cellule del tutto paragonabile tra i tuoi campioni puoi sperare di normalizzare il risultato con una proteina housekeeping se devi farci un western-blot (semplicemente usando lo stesso volume di Laemmli e caricando lo stesso volume nel gel). Il vantaggio � che si tratta di una lisi e estrazione immediata e piuttosto forte, quindi rischi meno che la tua proteina si degradi e solitamente ottieni estratti piuttosto concentrati. Di solito con questo metodo liso le cellule in Laemmli2x, e dopo aver recuperato il campione lo sonico brevemente per frammentare il DNA genomico che altrimenti ti rende impossibile un caricamento "pulito" sul gel. Poi solita bollitura a 95�C e centrifugata a massima velocit� prima di caricare.

CrackTheBrain
Nuovo Arrivato

6 Messaggi

Inserito il - 15 aprile 2017 : 10:58:17

Scritto da MolecularLab Mobile

Ciao Geeko, una curiosit�,come mai centrifughi prima di caricare? Hai notato dei miglioramenti facendolo? Perch� io solitamente ometto il passaggio della centrifugazione e ottengo comunque campioni puliti in W.blot