Puoi usare la terminal transferasi (TdT) con un nucleotide marcato e così facendo marchi in 3'.
Es:
5'--------3' + 3H-dTTP + TdT ---> 5'--------T*T*T*T*T*3'
Altra opzione è fare RT-PCR includendo un nucleotide radioattivo e in questo modo marchi per tutta la lunghezza della sonda. Questo lo puoi fare con random primers o con primers specifici, l'idea è la stessa.
Ci dovrebbe poi essere anche un modo per aggiungere nucleotidi al 5' ma al momento mi sfugge...
Per sonde ad RNA invece puoi clonare la tua sequenza in un plasmide con il promotore x la RNA pol e fare trascrizione in vitro con nucleotidi radioattivi. In questo modo marchi per tutta la lunghezza della sonda
Questo è il protocollo che uso io con 35S-dUTP
http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=19
emergenza! Sonde molecolari
Didattica e Relazioni
Inserito il - 10 aprile 2007 : 16:05:33
aiuto!
Inserito il - 11 aprile 2007 : 00:32:34
