PCR E CLONAGGIO

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Claudia98
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Inserito il - 19 novembre 2020 : 14:43:09

Sto svolgendo degli esercizi di Tecnologie del DNA ricombinante.
Vorrei capire la procedura esatta per clonare in un plasmide un amplicone ottenuto per PCR.
Un esempio di testo dell�esercizio � questo:
La seguente sequenza di DNA corrisponde a quella di un amplicone di 400bp ottenuto con i primer PLUS e MINUS (sotto riportati)
5�ATGAAACCAT TCTTCCTCAT TTCGCTGCTG GTCACGGTCT TCATGAGCCT CATGTTGGCC
ACCACCGCTC AACCCAGCCT TCCACTCAAC AACCGGCGGG AACTTGCTGA GCATCCCCCA
GTCAAGGGTA ACCCCCCAAA CACCGGCTAT CTATAAAGGC CATGAGCAAT ACCGTGAGAG
TGAGCCGTCT CACAAGATGA TGGACACGAT GGTCGCTTCT GAATCGTCGG ACGTGTTTGA
TGGGATGGAC GCCGATGAAG CGAGGGACGC TCTCAATCCA TATCTTTCTG AAGAGAAGAC
CAAAGAGTAC TACGATCGTG CCCTAGCGCG TTACAACAAG TGTGTTGAGG AAGCCATGGC
GCAAGGCATT GACCTTCAGA AATACTGGGC CGCTTTTTAG 3�
PLUS 5' ATGAAACCATTCTTCCTCATTTC 3' MINUS 5' CTAAAAAGCGGCCCAGTATTTC 3�
L'amplicone � stato clonato nel sito EcoRV (estremit� piatte) del vettore pYES2 di cui � riportata la mappa di restrizione e un tratto di sequenza corrispondente alla regione di policlonaggio
Progettare i primer (scrivere la loro sequenza da 5'->3') e la procedura da eseguire per stabilire mediante PCR l'orientamento dell'inserto nei cloni ricombinanti ottenuti. Calcolare all�incirca la dimensione degli ampliconi previsti.
Per tutte le reazioni di PCR definire la Temperatura di "annealing" che si dovr� utilizzare.