| Autore |
Discussione |
|
|
samu
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
 Inserito il - 05 giugno 2007 : 17:03:12
|
Ciao a tutti...
sto provando ad estrarre DNA da tessuto con la metodologia descritta nel datasheet del trizol (perchè principalmente mi interessa anche l'RNA) qualcuno do voi usa questa metodica?? funziona bene????
grazieeee
|
|
|
|
|
Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
 Inserito il - 06 giugno 2007 : 10:11:34
|
| Io ho estratto RNA, DNA e proteine col trizol...dovrei recuperare i protocolli però... |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
 |
|
|
elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2007 : 15:05:25
|
dipende cosa devi fare. se parti da tessuti non fissati o fissati con etanolo, acetone o metanolo il trizol va benissimo e ottieni delle rese veramente buone, ma se parti con tessuti fissati con fissativi che parzialmente crossilinkano (io uso un fissativo al 4% formaldeide) DNA, RNA e proteine ti consiglio di usare un kit (costa di piu' ma estrai che e' un piacere)...
|
|
|
|
samu
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2007 : 15:31:44
|
Parto da pezzi freschi di polmone umano...quindi non è materiale fissato.. funziona?? grazie...
|
|
|
|
Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2007 : 15:53:26
|
| Se serve il protocollo, io ce l'ho...Abbiamo estratto con Biologia Molecolare l'RNA da una coltura di cellule...Non so se si possa adattare... |
 
 |
|
|
|
ChyDB
Nuovo Arrivato
Prov.: Perugia
Città: Perugia
4 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2007 : 16:09:28
|
Ciao, Io estraggo abitualmente RNA con Trizol da cellule e funziona che è una meraviglia (anche se puzza che è una meraviglia!!)! Per cercare di recuperare il più possibile dal nostro esiguo campione, abbiamo provato anche la successiva estrazione di DNA.... Un disastro,ti dico solo che il pellet era ROSA!! Ti consiglio di provare un kit dotato di colonnine cromatografiche per l'estrazione del DNA, è sicuramente più efficiente
 |
|
|
|
samu
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2007 : 16:12:44
|
Se non ti rompe, Schuldiner86, sì, cosi ho modo di confrontarlo con il mio..
GRAZIE ANCORA!!
..subito dopo la prima centrifugata per ottenere le 3 fasi mi si impacca tutto il DNA e non so se questo è un bene oppure no non avendolo mai fatto..
 |
|
|
|
Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2007 : 16:51:09
|
Detto fatto:
Esercitazione 1: ESTRAZIONE RNA (metodo del TRIZOL)
#61558; Eliminare il terreno di coltura dalla fiasca da 25 cm2 con una pipetta sterile.
#61558; Lavare con 5 ml di PBS Dulbecco (tampone isotonico) pH 7.2 sterile la fiasca da 25 cm2.
#61558; Aggiungere sotto cappa 2.5 ml di TRIzol Reagent per lisare le cellule.
#61558; Incubare 5 min a RT (temperatura ambiente) per permettere la dissociazione dei complessi nucleoproteici.
#61558; Recuperare il lisato cellulare ripartendolo equamente in due eppendorf da 1.5 ml .
#61558; Aggiungere ad ogni eppendorf (epp.) 250 #61549;l di cloroformio, chiudere i tappi ed agitare per circa 30 sec le due epp.
#61558; Incubare 2 min a RT e poi centrifugare a 12000g per 15 min; dopo la centrifugazione la miscela si separa in una fase inferiore rossa, costituita da fenolo-cloroformio, in una interfase ed in una fase superiore incolore dove si ripartisce l’RNA
#61558; Recuperare circa 400 #61549;l della fase superiore da ciascun epp. e trasferire in due nuove epp.
#61558; Aggiungere a ciascuna epp. 625 #61549;l di alcool isopropilico per precipitare l’RNA.
#61558; Dopo aver miscelato incubare 10 min a RT e quindi centrifugare 10 min a 16000g.
#61558; Eliminare attentamente il sovranatante, controllando la presenza del pellet di RNA precipitato sul fondo delle epp.
#61558; Aggiungere a ciascuna epp. 400 #61549;l di etanolo al 75% per lavare il pellet di RNA.
#61558; Dopo aver miscelato la soluzione con il vortex, centrifugare 10 min a 16000g.
#61558; Eliminare attentamente il sovranatante e lasciare asciugare il pellet di RNA all’aria per circa 10 min.
#61558; Sospendere accuratamente entrambi i pellets di RNA in 50 #61549;l di H2O DEPC e poi riunire in un’unica eppendorf.
REAGENTI RICHIESTI:
1. PBS Dulbecco (8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.15 g/l Na2HPO4, 0.2 g/l KH2PO4, H20 fino ad 1l)
2. TRIzol reagent (Invitrogen)
3. Cloroformio
4. Alcool isopropilico
5. 75% etanolo in H2O DEPC
6. H2Od DEPC 0.1%
Estrazione dell'RNA Totale:
Consiste nell’isolamento e nella purificazione dell’RNA sia da cellule eucariotiche che procariotiche.
Le cellule vengono lisate utilizzando un reagente specifico, il Trizol, costituito da fenolo e guanidina isotiocianato. Il fenolo è un agente denaturante le proteine.
La guanidina isotiocianato è un forte agente denaturante che garantisce la inattivazione delle RNAsi.
L’aggiunta del cloroformio (CHCl3) permette la formazione di tre fasi che dopo la centrifugazione si ripartiscono in:
una fase superiore acquosa contenente RNA;
un’interfase molto sottile lattescente costituita da proteine denaturate e DNA;
una fase organica sottostante contenente lipidi, proteine denaturate e DNA.
Nota: la ripartizione del DNA nell’interfase e nella fase organica inferiore
è dovuta al pH acido (circa 5.2) del Trizol. In condizioni di pH prossime
alla neutralità il DNA si ripartirebbe, infatti, nella fase acquosa superiore
In che senso ti si impacca...Noi quando abbiamo usato sto protocollo la fase intermedia, quella col DNA, sembrava tipo un qualcosa di bianco precipitato sopra alla fase rosa... |
|
|
|
|
zio
Utente Junior
Città: Napoli (IRAQ)
120 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2007 : 16:55:50
|
non voglio dire il cotrario, però ricordo che alcuni kit che usano colonnine non siano adatti per l'estrazione da polmone per via di non so cosa presente nell'organo.
per esempio per l'estrazione di RNA virale con il kit della Roche (high pure RNA isolation kit)gli esperti sconsigliavano l'estr. da polmone.
 se riesco a reperire ulteriori notizie vi faccio sapere. |
zio |
|
|
|
ll cool p
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2010 : 11:57:24
|
ciao a tutti,
ma per estrarre le proteine da pezzi di polmone mediante il Trizol, come devo fare?? |
|
|
| |
Discussione |
|
Trizol : RNA e DNA ?!
Didattica e Relazioni
