| Autore |
Discussione |
|
|
powergirl
Nuovo Arrivato
Città: potenza
35 Messaggi |
 Inserito il - 20 settembre 2007 : 12:48:16
|
ciao a tutti! ho lavorato per alcuni anni in biologia molecolare, quindi tra estrazioni rna, dna e pcr..però mai su sangue! ora mi ritrovo a dover mettere a punto il protocollo per la separazione del sangue periferico e del midollo, per poter poi estrarre dna ed rna dai bianchi. ma non riesco mai ad ottenere una buona quantità di bianchi, pure partendo da prelievi di 5-6 ml..forse non riesco a prelevare bene il buffy coat, nè usando il ficoll, nè senza..aiutatemi!avete qualche metodica che funziona? grazie!
|
|
|
|
|
memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2007 : 21:52:51
|
 non so che tipo di globuli bianchi tu debba purificare ma potresti utilizzare il Lympholyte-H, specifico per linfociti e monociti al posto del ficoll. |
 |
|
|
powergirl
Nuovo Arrivato
Città: potenza
35 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2007 : 09:10:04
|
| si, ho provato anche quello..il problema è come prelevare i bianchi! nel senso che nel prelevarli con la pasteur di plastica ovviamente prendo anche i rossi, poi vado a lisare con un eritrolisante ma alla fine le cellule vitali (non colorate dal trypan blue) che mi rimangono sono poche!hai un protocollo che funzioni? grazie! |
|
|
|
memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2007 : 21:22:04
|
| I linfociti, che poi sono i bianchi che vai ad isolare utilizzando il Lympholyte, sono cellule estremamente delicate per cui è molto comune perderne una grande quantità. Inoltre nel buffy coat non sai mai quante cellule sono presenti ed è difficilissimo fare delle stime attendibili da un isolamento all'altro. Prima di utilizzare l'eritrolisante prova a fare dei lavaggi con PBS per pulire ulteriormente le cellule e magari riduci il tempo di trattamento. Io se non sbaglio facevo tre lavaggi con PBS e poi lasciavo le cellule 10 minuti in incubazione sotto cappa con NH4Cl pH 7.4. Poi centrifugavo, sospendevo in terreno fresco e contavo. Putroppo non ho il protocollo a disposizione al momento |
|
|
|
marisch77
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
Città: bitetto
11 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2007 : 20:45:36
|
ti invio il protocollo di isolamento che generalmente usiamo in laboratorio con un buon isolamento...spero ti sia utile...ciao
ISOLAMENTO PBMC
1. Colezionare 20 ml di sangue periferico in provette di L-eparina
2. Diluire almeno 1:2 con soluzione fisiologica (in un tubo da 50 ml sterile)
3. Stratificare DELICATAMENTE sul fondo del tubo 10 ml di Ficoll per preparazioni linfocitarie (Ficoll-Paque)
4. Centrifugare a 1500 RPM per 30’ a temperatura ambiente (RT)
5. Eliminare una parte di siero e recuperare l’anello centrale contenente PBMC (con una pasteur di vetro sterile), con il restante siero, evitando accuratamente di prelevare il pellet rosso. Porre in un altro tubo da 50 ml sterile.
N.B. D’ora in poi lavorare in ghiaccio
6. Lavare due volte con ice-cold soluzione fisiologica e centrifugare a 1500 RPM, 10’ a 4°C (dopo ogni centrifuga eliminare il sovranatante e sbattere il pellet #61614; aggiungere soluzione fisiologica e ricentrifugare)
7. Risospendere in 10 ml di soluzione fisiologica (aggiungere prima 3 ml di sol. Fisiologica e risospendere con pasteur cotonata poi aggiungere altri 7 ml).
8. Dai 10 ml prendere 50 #61549;l + 450 #61549;l di TURK per la lettura nella camera di Burker
9. Centrifugare a 900 RPM per 10’ a 4° C per allontanare le piastrine
10. Risospendere in medium completo alla concentrazione desiderata
MEDIUM COMPLETO (da sterilizzare in SteriCup)
500 ml 50 ml
• RPMI 1690 (EuroClone, EC B9006L) 440 ml 44 ml
• 10% FCS (-20°C) 50 ml 5 ml
• 1% L-glutammine (-20°C) 5 ml 0.5 ml
• 1% antibiotici (-20°C) 5 ml 0.5 ml
N.B.
FCS: quando viene comprato prima di aliquotarlo va scomplementato a 56° per 30’
TURK
• 100 mg violetto di genziana
• 31.25 acido acetico glaciale puro
Portare a 500 ml con H2O bidistillata e lasciare in agitazione overnight. La mattina seguente va filtrato
|
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
|
marisch77
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
Città: bitetto
11 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2007 : 07:35:00
|
ciao chick80!!!
mi sono iscritta appena ieri e devo capire ancora cosa posso fare..cmq lo farrò nei prox giorni...ciao |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2007 : 09:18:04
|
No problem!
Se segui il link nel mio messaggio precedente puoi scegliere "Inserisci protocolli" ed inserirlo lì, verrà automaticamente messo nel nostro database!
Grazie e ciao!
nico
|
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
powergirl
Nuovo Arrivato
Città: potenza
35 Messaggi |
 Inserito il - 02 ottobre 2007 : 10:10:35
|
| vi ringrazio tutti! la separazione con il ficol o con il limpho separatium medium viene bene..il problema però è che non si può reinfondere nei pazienti! quindi per la ricerca va bene, ma quando si tratta di reinfondere i linfociti da donatore a ricevente non va bene! quindi per questo cercavo una metodica alternativa, in grado di separare i bianchi solo per centrifugazione e poi lisare i rossi..non avete protocolli a riguardo?grazie! |
|
|
| |
Discussione |
|
buffy coat
Didattica e Relazioni
