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coccinellas
Utente Junior
Città: l'isola che non c'è
138 Messaggi |
 Inserito il - 06 ottobre 2007 : 18:06:58
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Salve ragazzi,
sapete indicarmi un buon sito su cui studiare in maniera approfondita le tecniche elettroforetiche?
anticipatamente grazie
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MrX83
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
20 Messaggi |
 Inserito il - 06 ottobre 2007 : 18:18:47
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Ciao coccinellas...ti posto una parte dei riassunti sulle tecniche ke ho fatto recentemente x un'esame; la parte in questione parla proprio dell'elettroforesi. Se ti serve sapere qualcosa di più specifico chiedo pure e vedrò di aiutarti ;)
ELETTROFORESI SU GEL (2)
L’elettroforesi su gel è una tecnica di separazione per le molecole di DNA e di RNA; ne sono utilizzate tre varianti.
La prima è l’elettroforesi in gel di poliacrilamide (PAGE) che fu introdotta come metodo di separazione per le proteine ma che può essere ugualmente utilizzata per la separazione degli acidi nucleici. La dimensione dei pori di un gel di questo tipo può variare in funzione della percentuale di poliacrilamide (dal 3 al 30%) utilizzata per preparare il gel. Questo permette di separare molecole di diversa dimensione. PAGE è una tecnica molto efficiente per l’analisi delle molecole di DNA, in quanto è in grado di separare molecole che differiscono anche per una sola coppia di basi. L’elevato livello di risoluzione rende il metodo ideale per il sequenziamento del DNA. Tuttavia, la tecnica è limitata all’analisi di molecole di DNA relativamente piccole (meno di 100 bp). Molecole di DNA più lunghe non riescono ad entrare nei pori della poliacrilamide e di conseguenza non vengono separate.
L’agarosio è un colloide estratto da un’alga. È un polisaccaride lineare costituito da unità di base ripetute di agarobiosio. I gel di agarosio si preparano sospendendo la polvere di agarosio, a concentrazioni variabili dall’1 al 3%, in un tampone acquoso e quindi bollendo fino a formare una soluzione limpida. Questa viene poi versata in uno stampo per gel, che contiene un pettine per creare dei pozzetti, e lasciata raffreddare a temperatura ambiente per formare un gel. Dopo la formazione del gel, si rimuove il pettine e i campioni di DNA possono essere caricati nei pozzetti ottenuti. Il gel è quindi sottoposto ad un campo elettrico costante e il DNA migrerà nel gel verso l’elettrodo positivo (anodo). La risoluzione di un gel di agarosio è inferiore rispetto a quella ottenuta con il PAGE. Le bande che si formano in un gel di agarosio sono abbastanza diffuse in quanto il diametro dei pori non può essere accuratamente controllato. Un gel all’1% contiene una grande varietà di dimensione di pori, mentre quello al 2% contiene in media pori più piccoli però ancora con dimensioni molto variabili. Una volta che i frammenti di DNA sono stati separati mediante il gel di agarosio, per poterli visualizzare devono essere colorati. Il metodo più comune implica l’immersione del gel in una soluzione di etidio bromuro, una molecola planare in grado di intercalarsi tra le coppie di basi impilate del DNA. Il legame dell’etidio bromuro al DNA provoca una distorsione della struttura a doppia elica ed uno srotolamento localizzato. Il bromuro di etidio lega meglio il DNA a doppio filamento rispetto a quello a singolo filamento e all’RNA, a causa dell’inferiore impilamento delle basi azotate. L’illuminazione con luce UV (lunghezza d’onda 260-300 nm) del gel così trattato, provoca la fluorescenza dell’etidio bromuro, che permette all’interno del gel la visualizzazione del DNA come una banda di fluorescenza. Utilizzando i gel di agarosio si ottengono ottime separazioni di molecole di DNA comprese nell’intervallo 200-15000 bp. Due fattori principali regolano la velocità con cui un frammento di DNA migrerà attraverso un gel applicando una corrente costante: la sua massa molecolare (lunghezza) e la sua struttura tridimensionale (forma)
Per superare il problema della limitazione della risoluzione dovuta alla lunghezza delle molecole è stato introdotta l’elettroforesi in campo pulsato (PFGE) come metodo per separare molecole di DNA molto lunghe. Piuttosto che far migrare le molecole in un campo elettrico statico, si modifica la direzione della corrente elettrica per alterare il cammino delle molecole di DNA, man mano che si muovono all’interno del gel. Utilizzando questo metodo, il limite superiore di separazione in gel di agarosio è stato innalzato da 30-50 kb a più di 10 Mb (10000kb). |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2007 : 18:47:25
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Proprio su MolecularLab c'è un'ottima sezione didattica, per le tecniche elettroforetiche ed altri argomenti comincia a dare uno sguardo quì
Buona lettura
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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coccinellas
Utente Junior
Città: l'isola che non c'è
138 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2007 : 18:49:01
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Grazie Mrx83,
sei stato gentilissio!
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coccinellas
Utente Junior
Città: l'isola che non c'è
138 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2007 : 18:54:03
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Grazie anche a te Iside!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 ottobre 2007 : 00:05:58
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Riscrivo solo il link di Iside perché c'è un errore e non funziona:
Elettroforesi |
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tecniche elettroforetiche!
Didattica e Relazioni
