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Discussione |
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Dorina
Nuovo Arrivato
Prov.: Monza
Città: Milano
30 Messaggi |
 Inserito il - 14 novembre 2007 : 15:57:29
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Salve, ce qualcuno che sa spigare i metodi, di rivelazione di Ag, utilizzati in immunoistochimica? Perchè non ho materiale su questo argomento.Grazie
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Dorina Qehajaj |
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2007 : 21:04:45
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RIESPOSIZIONE DI ANTIGENI CELATI:
Il problema conseguente alla fissazione è lo smascheramento dei siti antigenici.
Un metodo è l’uso di enzimi proteolitici, che consentono una digestione dei legami aldeidici,
consentendo così la disponibilità dei siti antigenici ricercati.
Gli enzimi più usati sono: la tripsina e la pronase. Il tempo di digestione può variare in funzione
delle condizioni del campione e dell’enzima usato.
Una digestione eccessiva può danneggiare il tessuto, perciò i tempi di incubazione dovrebbero
essere i più brevi possibili. Quando gli enzimi digeriscono i legami aldeidici possono causare il
distacco e la perdita delle sezioni di tessuto dal vetrino. Si dovrebbero usare quindi vetrini a carica
elettrostatica o trattati con un adesivo ( es: Silano ).
Altro metodo usato comunemente per lo smascheramento antigenico è l’utilizzo delle alte
temperature: forno a microonde, pentola a pressione, bagnomaria.
I mezzi nei quali effettuare lo smascheramento sono soluzioni di vario tipo a pH variabile che vanno
dal tampone citrato, all’EDTA, all’EGTA, oppure soluzioni di urea.
A tutt’oggi non è del tutto chiarito come la combinazione calore-soluzione tampone renda
accessibili quei siti antigenici un tempo identificabili soltanto su materiale criopreservato. Tra le
ipotesi avanzate, alcune riconducono l’efficacia del sistema alla precipitazione o alla chelazione
degli ioni calcio legati ai tessuti e dei cationi metallici divalenti. L’allontanamento di tali
componenti ioniche, dovuto sia al calore che al tipo di soluzione utilizzata durante la fase di
riscaldamento, smaschererebbe un’ampia gamma di siti combinatori stabilizzati dai procedimenti di
fissazione.
L’approccio basato sulle alte temperature appare efficace con tipi diversi di fissativo e minimizza le
variazioni di immunoreattività legate all’impiego di tempi di fissazione diversificati ( da un giorno
ad alcune settimane ). L’unica condizione che riduce l’efficacia delle nuove tecniche di
smascheramento antigenico mediante calore è rappresentata dalla sottofissazione; le componenti
tissutali non fissate adeguatamente, infatti vanno incontro ad un processo di denaturazione.
Per quanto riguarda lo smascheramento con forno a microonde ( probabilmente il più usato ) c’è da
tener presente per lavorare sempre nelle stesse condizioni:
1. I vetrini devono essere sempre ben coperti dalla soluzione tampone durante tutti i cicli di
bollitura;
2. Il numero di vetrini deve essere sempre lo stesso affinchè il trasferimento di calore alla sezione
di tessuto sia costante durante il trattamento.
3. La posizione dei vetrini deve essere la stessa.
Un limite del microonde di tipo “usuale” è di non poter controllare precisamente l’emissione dei
watt da parte del magnetron, ma per ovviare a questo problema esistono in commercio dei forni a
microonde in grado di controllare questo aspetto, nonché la temperatura.
Smascheramento con pentola a pressione: tra le fonti di calore, la pentola a pressione, pur
determinando un minimo deterioramento dei fini dettagli citologici risulta molto maneggevole e
consente il simultaneo trattamento di un n° elevato di sezioni ( 80-100 secondo il tipo di pentola ),
permettendo l’omogenea distribuzione del calore, e la riduzione dei tempi di lavoro.
Smascheramento con bagnomaria: pur richiedendo un tempo più lungo rispetto al microonde
permette di avere una costante temperatura su tutta la superficie del vetrino.
Quello appena letto l'ho trovato su internet
Metodi di rivelazione dell’antigene (“antigen retrieval”)
CHIMICI
enzimatici:
• proteinasi K;
• tripsina;
• pronasi.
Si tratta di proteasi, la cui funzione è quella di scindere i crosslink che si sono formati nel tessuto a causa della formalina
FISICI
Calore:
• bagnetto a 97° C;
• microonde;
• pentola a pressione
Ultrasuoni
Questo in breve è quello che so |
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Dorina
Nuovo Arrivato
Prov.: Monza
Città: Milano
30 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2007 : 02:54:08
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| Grazie, ma a me servono i metodi come parossidasi antiperossidasi, faosfatasi alcalina anti fosfatasi alcalina anche avidina-biotina complex. Forse non ero spiegato bene però se sai qualcosa mi aiuto molto. |
Dorina Qehajaj |
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Giulietta85
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 02 gennaio 2008 : 17:49:50
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| Ciao! Ho bisogno di aiuto! Vorrei sapere come, nella tecnica dell'immunoistochimica, i fissativi mascherano l'antigene. Lo smascheramento dell'antigene va sempre effettuato oppure solo in casi di fissazione inappropriata (ipo e iperfissazione)? |
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 03 gennaio 2008 : 22:54:06
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per dorina...prova a dare un'occhiata qui...http://www.ihcworld.com/introduction.htm credo che ci siano cose interessanti
per giulietta...non ho moltissimissima esperienza sull'immunoistochimica,comunque lo smascheramento dell'antigene l'ho sempre fatto. Non so darti una risposta precisa su come i fissativi mascherino l'antigene, so per esempio che la formalina, crea dei cross-link, presumo che proteine cross-linkate possano essere più difficilmente legate dagli anticorpi, poichè l'epitopo potrebbe non essere più riconosciuto.
Spero che qualcuno risponda più precisamente alla tua domanda in modo che anche io possa avere le idee più precise e se ho detto cose sbagliate possa correggerle.
ciao |
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giova
Nuovo Arrivato
Prov.: Ferrara
Città: ferrara
2 Messaggi |
Inserito il - 07 gennaio 2008 : 15:12:13
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| ho sempre fissato con paraformaldeide 4% e non ho mai fatto lo smascheramento... |
jah sittet in mont Zion and rules all creation |
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Cri
Nuovo Arrivato
Città: Rovigo
68 Messaggi |
Inserito il - 07 gennaio 2008 : 19:06:24
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I pretrattamenti (calore, digestione enzimatica) vanno fatti sulle sezioni di campioni fissati in formalina.
Pretrattare (=smascheramento antigenico) significa rompere quella reticolazione che si forma tra lemolecole proteiche (si creano ponti metilenici(CH2) tra diversi gruppi amminici, ossidrilici,...) in modo tale che l'antigene da ricercare sia accessibile e riconoscibile all'anticorpo. Dopo la sparaffinatura si portano le sezioni all'acqua attraverso una serie decrescente di alcool e poi si procede allo smascheramento, quindi alla tecnica d'immunoistochimica.
Se usi un sistema di rilevazione con perossidasi dovresti tarare il tempo migliore (utilizzando una soluzione di perossido d'idrogeno H2O2 al 3% in H20 o in metanolo) per il blocco della perossidasi endogena che causerebbe una colorazione non specifica.
Se ho una ipofissazione si ha una scarsissima reticolazione (non necessita di smascheramento) ma non ho un'adeguata morfologia da leggere al microscopio
Il tipo di smascheramento,i tempi d'incubazione, il sistema di rivelazione utilizzato saranno decisi in base alle condizioni di laboratorio dove operi (il tempo medio di fissazione del tuo campione, che antigene devi ricercare, e su quale tessuto). Naturalmente dovrai sempre mettere un controllo positivo.  |
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Cri
Nuovo Arrivato
Città: Rovigo
68 Messaggi |
Inserito il - 07 gennaio 2008 : 19:28:46
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Inoltre dovrai leggere attentamente il data sheet che è una specie di carta d'identità dell'anticorpo.
In sintesi se hai lavorato bene considerando tutte le variabili dovrai ottenere una nulla o al massimo una bassissima colorazione aspecifica (=di fondo ) che darà maggior contrasto
alla colorazione specifica rendendo più facile l’interpretazione
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metodi di immunoistochimica
Didattica e Relazioni
