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caso1986
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Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
 Inserito il - 18 gennaio 2008 : 12:08:43
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premesso che è per un esame di genetica da 1 credito la prof ci ha lasciato il protocollo e noi dobbiam mandarle una relazione su email...per prenotarsi all esame...IL PROBLEMA è ke è dettagliatissimo il protocollo nn saprei cosa aggiungere...velo copio incollo magari aiutatemi.GRAZIE
1)Inoculare la colonia batterica in 2 ml di LB(cos'è LB) + Ampicillina (100 mg/ml) e incubare a 37 gradi in agitaione overnight(cosa vuol dire in agitazione overnight?come si inocula la colonia?)
2)trasferire 1.5 ml di coltura batterica in eppendorf da 1.5 ml(sn pipette vero?)
3)centrifugare a velocità massima x 2 min con temperatura ambiente
4)eliminare il sovranatante formatosi e risospendere in 200 microlitri di TE(cos' è il te?)
5)aggiungere 200 ml di soluzione di lisi(naoh 0.2 normale e SDS so cos'è:-)) da preparare al momenento e miscelare delicatament einvertendo il tubo(cosa vuol dir einvertire il tubo)
6)incubare a temperatura ambiente per 5 minuti(dove si incuba?)
7)aggiungo 300 ml ch3cook 3 m ph 5.5 miscelo delicatamente e inverto il tubo(ancora con sto tubo...io micca mi ricordo er aun mese fa...aiuto grazie)
8)incubare 5 minuti in ghiaccio.
9)centrifgare max speed 10 minuti temperatura ambiente
10)prelevare sovranatante e evitando di cogliere qualcosa del precipitato e metterlo in una nuova eppendorf
11)asciugare sovranatante 2.5 volumini di etanolo 95% e miscelare delicatamnte indovinate come?invertendo il tubo
12)precipto meno 80 gradi x 30 min(dove?)
1)centrifugo 130000 rpm x 15 min a 4 gradi
14)lavo il pellet (cos'è?) con 100 ml di etanolo 70%
15)asciugo e rispospendo in TE(COS'è TE)
NON GUARDATEMI COME UN DEMEMNTE MI STO PER LAUREARE DA NUTRIZIONISTA E DI GENETICA NN CAPISCO UN H...GRAZIE MILLE
FILIPPO
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Shatzy
Nuovo Arrivato
Città: PEsaro
6 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2008 : 12:52:50
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Allora...non ho ben capito cosa chiedi, comuqnue intanto posso rispondere alle tue domande!!
Citazione:
1)Inoculare la colonia batterica in 2 ml di LB(cos'è LB) + Ampicillina (100 mg/ml) e incubare a 37 gradi in agitaione overnight(cosa vuol dire in agitazione overnight?come si inocula la colonia?)
L'LB è il terreno di coltura in cui si fanno crescere i batteri (uno dei tanti in realtà, ma comunque l'LB è credo il più usato!!(LB sta per Luria-Bertani) per l'inoculo si prende con un'ansa (una specie di bastoncino che forse avrai usato se avete fatto delle esercitazioni di microbiologia) una singola colonia dalla piastra e poi si "sciacqua" l'ansa in un tubo (cioè una provetta) contentente il terreno con l'antibiotico. Il tubo viene poi lasciato tutta la notte a 37°C in un bagnetto che permette di agitare il tutto.
Citazione:
2)trasferire 1.5 ml di coltura batterica in eppendorf da 1.5 ml(sn pipette vero?)
No le eppendorf non sono pipette, sono, diciamo, delle provettine
Citazione:
4)eliminare il sovranatante formatosi e risospendere in 200 microlitri di TE(cos' è il te?)
Il TE è un tampone acquoso, costituito da Tris ed EDTA.
Citazione:
5)aggiungere 200 ml di soluzione di lisi(naoh 0.2 normale e SDS so cos'è:-)) da preparare al momenento e miscelare delicatament einvertendo il tubo(cosa vuol dir einvertire il tubo)
...Invertire vuol dire..invertire!!! Capovolgere...
Citazione:
6)incubare a temperatura ambiente per 5 minuti(dove si incuba?)
...a temperatura ambiente!! Sul bancone!!!!
Citazione:
12)precipto meno 80 gradi x 30 min(dove?)
in un frigorifero che arrivi a -80°c...
Citazione:
14)lavo il pellet (cos'è?) con 100 ml di etanolo 70%
Il pellet è il precipitato, quello che rimane sul fondo dopo che hai centrifugato..
Spero di averti almeno aiutato a chiarire le idee!!!
In bocca al lupo!
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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2008 : 18:37:29
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| sei un grande.perkè queste parti di laboratorio servono ad alzare il voto.il resto è altro.quindi spiegando addirittura che te è tris edta sono un figo!grazie |
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caso1986
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
Città: bologna
79 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2008 : 20:15:51
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posto la mia relazione ringraziando ancora mai che non servisse a qualcuno
ESTRAZIONE DEL DNA PLASMIDICO MEDIANTE IL METODO DELLA LISI ALCALINA
L'obbiettivo del laboratorio del 17/12 era quello di illustrare come poter estrarre e purificare DNA plasmidico da una cellula per poi poterlo utilizzare nelle procedure di trasfezione.
Il metodo che abbiamo utilizzato è quello della lisi alcalina secondo cui una volta effettuato un trattamento a PH alcalino(tra 12 e 12.5) , il DNA circolare plasmidico rinatura facilmente in seguito a neutralizzazione, fenomeno che invece non avviene per il DNA lineare.
Il vantaggio principale offerto da questo metodo è quello di consentire di estrarre DNA plasmidico anche da piccole colutre batteriche di 1-5 ml (in un procedimento chiamato mini-prep.), da cui è possibile estrarre fino a 10 micro grammi di DNA.
Dopo un trattamento purificativo con RNAsi per eliminare le tracce di RNA, il DNA plasmidico purificato può essere controllato con elettroforesi su gel di agarosio 1% per verificarne l'integrità
ELETTROFORESI:
è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso.
Le particelle si spostano verso il catodose hanno carica positiva e verso l' anodo se hanno carica negativa; nel primo caso il processo è detto cataforesi nel secondo anaforesi) su gel
AGAR-AGAR:
è un polisaccaride con funzione essenzialmente gelificante noto ai giapponesi con il nome di kantem, ottenuto da varie specie di alghe rosse e ritrovato le prime volte proprio nelle zone della penisola nipponica)
Le procedure osservate in queste esercitazione sono quelle che ci consentono di estrarre, appunto, il dna e poi poterlo usare per transfezione, dopo averlo valutato l'integrità come spiegato in precedenza.
Si è processo in questa maniera:
Ci veniva già fornita una coltura batterica preparata la giornata precedente tramite inoculazione di colonia batterica in 2 ml di LB+Ampicillina(100 mg/ml) e veniva incubato il tutto a 37 gradi C inagitazione overnight(cioè per il corso di una nottata)
AMPICILLINA:farmaco antibiotico derivato dalla penicillina, caratterizzato da ampio spettro antibatterico, efficace contro batteri sia gram-negativi sia gram-positivi. Nella forma orale è impiegato contro la maggior parte delle infezioni respiratorie, urinarie e intestinali; mentre quella parenterale è preferibile per le infezioni più gravi. Può dare false positività nella ricerca del glucosio nelle urine, determinare disturbi gastroenterici e diarrea, interferire con l’attività dei contraccettivi orali.
LB:terreno di coltura tra i più usati:LB sta per LURIA-BERTANI, l'inoculo viene effettuato con un ansa.
2)Abbiamo trasferito 1.5 ml di coltura batterica in una eppendorf calibrata 1.5 ml grazie all ausilio di pipette calibrate
EPPENDORF:Una sorta di provettina utile per gli scopi del laboratorio
3)Si è poi centrifugato a velocità massima per un tempo di 120 secondi alla temperatura ambiente
4)Dalla eppendorf centrifugata si eliminava il sovranatante e si risospendevano i batteri in 200 micro litri di TE
TE:sta per tris EDTA
EDTA:
L'acido etilendiamminotetraacetico, più noto con la sigla di EDTA è un acido carbossilico
A temperatura ambiente si presenta come una polvere cristallina moderatamente solubile in acqua, cui impartisce una reazione acida: una sospensione di 10 grammi di EDTA in un litrodi acqua ha pH circa 2,5.
Si prepara per reazione tra l'etilendiammina e l'acido cloroacetico.
L'EDTA trova larghissimo impiego in chimica analitica come agente chelante. La presenza di quattro gruppi carbossilici e di due atomi di azotofa sì che la molecola di EDTA sia in grado di formare complessi stabili con moltissimi cationi.
La stabilità di questi complessi rende l'EDTA il reagente più diffuso per la misurazione della concentrazione di numerosi cationi tramite titolazione complessometrica. L'esempio più comune di applicazione di titolazioni di questo tipo è costituito dalla misura della durezza dell'acqua.
L'EDTA è infatti in grado di formare complessi con gli ioni di calcio e magnesio, ma anche con gli ioni di rame e zinco e numerosi altri elementi.
Nella pratica analitica quotidiana, più che l'acido libero, è frequente l'uso del suo sale disodico diidrato C10H14N2O8Na2 · 2 H2O.
5)a questo punto si aggiungono 200 micro litri della soluzione di lisi preparata al momemento , miscelata delicatamente con anche inversione del tubo, cioè rovesciamento manuale delicato della provetta per mescolare meglio
(costituita da SDS 1%(sodio dodecenil solfato) ed NaOH 0.2 N):l'SDS lisa le cellule e denatura le proteine, l'NaOH crea un PH alcalino.
In questo passaggio il DDNA cromosomico circolare di E.coli viene frammentato in grossi frammenti lineari che sono denaturati dall'NaOH, mentre il DNA plasmidico di dimensioni più piccole viene solo denaturato dall'NaOH.
SDS:
Il laurilsolfato di sodio (o sodio laurilsolfato, sodio lauril solfato, sodio dodecilsolfato, dodecilsolfato di sodio, SLS, SDS) è un tensioattivo usato in molte famiglie di prodotti come dentrifico, shampoo, schiuma da barba e bolle di sapone grazie al suo effetto schiumogeno.
A temperatura ambiente si presenta come una polvere cristallina bianca, abbastanza solubile in acqua e etanolo.
La molecola è costituita da una coda idrofoba di 12 atomi di carbonio attaccata ad un gruppo idrofilo solfato, da cui le proprietà anfifiliche necessarie ad un detergente. Probabilmente è il surfattante anionico più studiato.
Si ottiene dalla solforazione dell'1-dodecanolo(o alcool laurilico, C12H25OH) seguita dalla neutralizzazione con il carbonato di sodio.
È usato sia in ambienti industriali che di cosmesi casalinga. Come tutti i detergenti tensioattivi, elimina il grasso dalla pelle e ne può causare l'irritazione.
Per etossilazione viene convertito nel lauretsolfato di sodio(o sodio lauriletere solfato, SLES), meno aggressivo verso la pelle perché è un denaturante meno efficace delle proteine.
NaOH: noto anche come soda, conosciuto per la forte componente Basica, è una delle basi FORTI.
6)incubare a temperatura ambiente per 5 minuti
7)aggiungo 300 ml CH3COOK(acetato di potassio) 3 m ph 5.5 miscelo delicatamente e inverto il tubo
CH3COOK:sale di potassio dell acido acetico.
A temperatura ambiente si presenta come un solido bianco dall'odore tenue di acido acetico.
8)incubare 5 minuti in ghiaccio
9)centrifgare max speed 10 minuti temperatura ambiente
10)prelevare sovranatante e evitando di cogliere qualcosa del precipitato e metterlo in una nuova eppendorf
11)asciugare sovranatante 2.5 volumini di etanolo 95% e miscelare delicatamnte invertendo il tubo
12)precipto meno 80 gradi x 30 min in un frigo specifico che sappia raggiungere detta temperatura.
13)centrifugo 130000 rpm x 15 min a 4 gradi centigradi
14)lavo il pellet con 100 ml di etanolo 70%
PELLET:Il pellet è il precipitato, quello che rimane sul fondo dopo che hai centrifugato
ETANOLO:alcool a catena corta (formula CH3CH2OH) alla base di tutte le bevande alcooliche.
Nota anche alcool o spirito di vino
15)asciugo e rispospendo in TE
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Estraz dna plasmidico con lisi alcalina...
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