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turok
Nuovo Arrivato
Prov.: Siracusa
Città: Siracusa
47 Messaggi |
 Inserito il - 18 gennaio 2008 : 16:10:01
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scusate ragazzi, ho un problema con una trasformazione di cellule di E. coli competente (DH5alfa), in poke parole quando dobbiamo traformare queste benedette cellule possiamo farlo mediante DNA purificato da soluzione, oppure da gel (NB: Il DNA che utilizziamo come vettore (un plasmide), unito con l'inserto (l'ABL/BCR della leucemia mieloide acuta) forma un costrutto di 4527 pb c.ca).
Qualora purifichiamo da soluzione (con il kit Qiagen) e trasformiamo, va tutto ok; nel senso ke i batteri crescono perfettamente su piasre cn LB Agar e Ampicillina (facciamo già tutte le prove possibili ed immaginabili, cioè i controlli positivi e negativi, cioè la conta dei batteri ke hanno preso il plasmide ke si è rikiuso su se stesso (il SELF), quelli ke hanno preso il plasmide ke non è stato digerito (il NO LIG) etc.).
Qualora andiamo a purificare da gel (con il kit Qiagen) è un dramma; nel senso ke nn cresce una mazza.
Abbiamo provato anke a trasformare altre cellule (dette cellule supercompetenti) mediante sia DNA purificato da soluzione (con il kit Qiagen), sia con quello purificato da gel (sempre con kit Qiagen) e come per le cellule di E. coli DH5 alfa, x il DNA purificato da soluzione le cellule sono cresciute su terreno, ma x il DNA purificato da gel, non cresce nulla.
Ragazzi AIUTOOOOOO!!!! VI PREGO!!!!!!!
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Non è perchè le cose sono difficili che non osiamo, ma è perchè non osiamo che le cose sono difficili.
Seneca.
è più facile spezzare un atomo che un pregiudizio.
Albert Einstein. |
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turok
Nuovo Arrivato
Prov.: Siracusa
Città: Siracusa
47 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2008 : 16:31:38
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| Scusate raga, ma la dimensione del costrutto è di c.ca 10 kb. |
Non è perchè le cose sono difficili che non osiamo, ma è perchè non osiamo che le cose sono difficili.
Seneca.
è più facile spezzare un atomo che un pregiudizio.
Albert Einstein. |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 19 gennaio 2008 : 19:58:56
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anche io ho avuto una volta un problema simile. secondo me il problema sta nella grandezza del plasmide.
per prima cosa prova a caricare sul gel più dna e in più pozzetti, in modo da avere una preparazione più abbondante.
poi dovresti fare delle prove nel variare parametri nell'estrazione dalle bande. dipende anche da che tipo di kit stai usando. nel mio caso (in cui il plasmide era 7Kb, ho risolto passando dal kit con resina a quello con colonnine. |
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powergirl
Nuovo Arrivato
Città: potenza
35 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 09:39:10
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| Non conosco questo kit per l'estrazione da gel, ma credo anche io che il problema sia la dimensione del plasmide. Ad esempio poterbbe essere troppo grande per migrare nel gel che tu usi (a che percentuale è?) e quindi (se ho capito bene come funziona la separazione) resta nel pozzetto in cui l'hai caricato! |
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vega
Nuovo Arrivato
Prov.: catania
Città: catania
8 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 14:19:59
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Ciao raga. ho avuto lo stesso problema......non potete immaginare come ho risolto dopo almeno 8-9 mesi di peripezie! in lab abbiamo comprato un nuovo transilluminatore e abbiamo utilizzato delle lampade UV già presenti in lab da qualche tempo ma mai usate....così abbiamo pensato che potevamo riciclarle......ma pensate te....erano lampade UVC.....hanno degradato totalmente il DNA......forse sembrerà un pò assurdo, ma una controllatina gliela darei....ricordati che il DNA va' visto 312nm  |
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 21:01:04
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| secondo me vega potrebbe averti dato il suggerimento giusto...se usi luce UV non adatta danneggi troppo il DNA e probabilmente è per questo motivo che non riesci ad ottenere colonie...ciao e facci sapere |
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Problema di trasformazione...
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