| Autore |
Discussione |
|
|
darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
 Inserito il - 21 gennaio 2008 : 12:09:27
|
ciao a tuuti.
volevo sapere se qualcuno ha avuto esperienze nel distinguere forme fosforilate e non di proteine in SDS-Page.
secondo voi, è possibile distinguere su gel una proteina fosfo-defosforilata con un solo sito di fosforilazione?
altre idee?
|
|
|
|
|
domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 12:15:44
|
Ma, intendi facendo semplicemente un SDS-Page?!Questo non lo so...perchè un fosforilazione/defosforilazione cambia talmente poco il peso della tua proteina che penso sia impossibile vederlo...
Puoi vederlo se usi un Ab contro la proteina fosforilata che non lega quella defosforilata (quindi, praticamente contro l'epitopo che ha la fosforilazione) oppure per 2D-SDS-Page...(che io sappia...ma mai fatto in pratica...) |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
 |
|
|
valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 13:08:33
|
In alcuni casi sembra sia possibile, ma e' una cosa del tutto imprevedibile!
Ho trovato un lavoro in cui distinguevano le due forme solamente usando un rapporto acrilamide-bisacrilamide pari a 149:1!
Se vuoi quando ho tempo cerco di trovarti l'articolo!
Ciao ciao |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 13:15:09
|
Citazione:
ciao a tuuti.
volevo sapere se qualcuno ha avuto esperienze nel distinguere forme fosforilate e non di proteine in SDS-Page.
secondo voi, è possibile distinguere su gel una proteina fosfo-defosforilata con un solo sito di fosforilazione?
altre idee?
Io l'ho fatto, ma avevamo 2 anticorpi, uno contro la forma fosforilata e uno contro la forma non fosforilata della proteina. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 14:46:20
|
Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Io l'ho fatto, ma avevamo 2 anticorpi, uno contro la forma fosforilata e uno contro la forma non fosforilata della proteina.
io faccio quasi sempre western per distinguere tra forma fosforilata e non dela stessa proteina e anche io ho sempre usato due anticorpi specifici. in alternativa si può immunoprecipitare la proteina di interesse e poi usare un anticorpo non specifico diretto contro i residui ammininoacidici fosforilati |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
|
Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2008 : 21:50:44
|
comunque se la proteina presenta un solo sito di fosforilazione possibile...penso che sia arduo distinguere la forma fosforilata da quella non fosforilata su gel in quanto la variazione di peso penso sia impercettibile...quoto la metodica proposta da Iside: immunoprecipitazione e decorare il blot con Ab anti-fosfo
Luca |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
|
|
|
Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 00:22:00
|
Per alcune protein chinasi tipicamente associate alle cascate
di trasduzione classiche (tipo ERK) esistono in commercio coppie
di anticorpi molto efficienti nel discriminare forma fosforilata e non. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
|
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 16:01:44
|
Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Per alcune protein chinasi tipicamente associate alle cascate
di trasduzione classiche (tipo ERK) esistono in commercio coppie
di anticorpi molto efficienti nel discriminare forma fosforilata e non.
verissimo, anche se a volte proprio per erk ho avuto problemi di cross-reazione degli anticorpi tra la forma fosforilata e non. la stessa cosa mi è successa per Jak. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
|
darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 17:16:09
|
| ok, allora facciamo il discorso alla rovescia (che poi è il mio caso). ho un anticorpo policlonale per la mia proteina. sulla lastra ho altre bande aspecifiche. all'altezza della mia proteina ho un doppietto che varia tra alcuni tessuti (di topo) wt e ko per un interattore della mia proteina. è pubblicato che questa proteina è fosforilata a livello di 1 aa. come faccio a sapere se il doppietto che vedo sono due forme della mia proteina o è solo "munnezza" dovuta al policlonale? |
|
|
|
valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 17:47:38
|
| Tratta il campione con fosfatasi e caricalo vicino al campione non trattato: se una banda sparisce, allora si trattava di una forma fosforilata! |
|
|
|
Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 17:48:04
|
ho fatto w.b. in cui distinguevo una proteina fosforilata e non, ma avevo due anticorpi, uno che riconosceva una forma non fosforilata e uno che riconosceva quella fosforilata, può essere che il doppietto che vedi è dovuto ad un diverso livello di fosforilazione, è abbastanza frequente per proteine che hanno siti di fosforilazione e secondo me la cosa migliore è trovare i due anticorpi, uno che ti riconosce la forma fosforilata e uno no.
|
|
|
|
Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 17:57:19
|
ho fatto w.b. in cui distinguevo una proteina fosforilata e non, ma avevo due anticorpi, uno che riconosceva una forma non fosforilata e uno che riconosceva quella fosforilata, può essere che il doppietto che vedi è dovuto ad un diverso livello di fosforilazione, è abbastanza frequente per proteine che hanno siti di fosforilazione e secondo me la cosa migliore è trovare i due anticorpi, uno che ti riconosce la forma fosforilata e uno no.
|
|
|
|
darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 18:35:33
|
| brava Valia, non ci avevo pensato! |
|
|
|
valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 18:47:42
|
Buon lavoro! |
|
|
|
Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2008 : 21:45:32
|
Anche a me è successa la stessa cosa...
Comunque, il fatto che la tua banda corra come doppietto può anche significare molte altre cose, non necessariamente la fosforilazione (che nel caso di un solo sito fosforilato dovrebbe essere impercettibile su gel): ad esempio la presenza di due varianti di splicing della stessa proteina oppure un grado di ubiquitinazione differente (molto frequente), senza dimenticare la possibile presenza di varianti dovute a compartimentazione in organelli di membrana (ad esempio nel Golgi)...
La cosa che ti consiglio vivamente è quella di immunoprecipitare la proteina e vedere come si comporta nell'IP: se decorando il blot con l'anticorpo anti-la tua proteina vedi che ha corso come doppietto, allora probabilmente sei di fronte a due varianti differenti, se invece non corre come doppietto e ottieni una sola banda allora il doppietto era aspecifico...nello stesso momento x verificare la possibile fosforilazione di una banda puoi decorare il blot con un anticorpo anti-fosfo generico (es. anti-pY se è fosforilato in tirosina) e se ottieni una banda in corrispondenza di una sola banda del presunto doppietto, allora sei di fronte alla forma fosforilata della tua proteina...se invece entrambe le bande risultano fosforilate (sempre assumendo che corra come doppietto) sei di fronte a due varianti diverse della stessa proteina...
Comunque per essere sicuro farei anche il metodo suggerito da Valia...
Buona fortuna!!! |
A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
|
|
| |
Discussione |
|
Western Blot e fosforilazione
Didattica e Relazioni
