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Discussione |
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titz
Nuovo Arrivato
Città: Benevento
7 Messaggi |
 Inserito il - 22 febbraio 2008 : 08:59:29
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bonjour...
stavo leggiucchiando il protocollo di immunocitochimica nella sezione delle tecniche e mi chiedevo se andasse bene anche per cellule trasfettate con il costrutto per la proteina che voglio localizzare nella cellula.
Altra domanda...ma è solo una curiosità: qual è la differenza tra i vari fissativi?
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titz |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2008 : 20:29:39
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guarda da quello che ho visto per la fissazione in immunoisto- e citochimica si va a casaccio , a priori non sai mai se per la fissazione è meglio usare acetone, formalina, formaldeide..ogni tessuto richiede una sua fissazione e se non sai qual è la migliore si può solo provare e vedere il risultato.
ci sono magari dei casi particolari dove sul datasheet dell'anticorpo da usare è scritto specificamente che è meglio una fissazione rispetto ad un'altra (a me è capitato con un Ab contro un sulfatide di membrana, perchè l'utilizzo di solventi organici avrebbe portato alla degradazione dell'antigene e quindi era da evitare l'uso di metanolo e affini) |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2008 : 20:40:55
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da quello che ho studiato per scoprire "l anigenicita'",prima di usare l anticorpo i campioni vengono trattati con tripsina e ....sali di calcio?..non mi ricordo  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2008 : 21:37:16
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Tripsina non l'ho mai sentito ma è possibile. Di solito si usa il triton.
Comunque soprattutto se il tuo antigene è intracellulare devi in qualche modo permeabilizzare la cellula.
La scelta del solvente è assolutamente empirica :) |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2008 : 22:14:23
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| forse si fa solo quando i campioni vengono tagliani con il microtomo o ultramicrotomo |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2008 : 05:44:51
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Ma, di solito noi abbiamo tessuto perfuso con paraformaldeide, tagliamo col microtomo e poi permeabilizziamo con triton.
Immagino sia semplicemente un altro metodo |
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betsim76
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 13 marzo 2008 : 13:08:22
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Provo a dare un po' di dritte:
1) I fissativi danno risultati diversi a seconda dei tessuti, é vero. Ma alcuni sono, se possibile, da evitare (o minimizzare): la glutaraldeide, in particolare, non é proprio indicata per l'immuno. Per quanto dia ottimi risultati morfologici, danneggia la specificità antigenica. Se non ci sono specifiche precise indicate nei data sheet degli anticorpi, di solito le miscele più gettonate (sia per la buona reattività che per la ben conservata morfologia)sono Paraformaldeide 4% (o formalina) in tampone fosfato 0,1M pH 7,4 e Bouin. Io preferisco la seconda perché la para fa coartare molto i tessuti e se c'é della cartilagine o dell'osso diventa dura stendere bene le fette.
2) Tripsina e Triton non sono la stessa cosa e non hanno la stessa funzione. Il primo é un enzima, il secondo un detergente. Il trattamento enzimatico (con tripsina, pronasi, peptidasi o altro) serve a smascherare l'antigene, bloccato nella griglia formata dalle molecole del fissativo. Si può operare anche per via termica (in autoclave o, ancora meglio, col microonde). Il detergente (io uso il Tween che é un po' meno drastico) serve a permeabilizzare le membrane e favorire la penetrazione dell'anticorpo, qualora il sito antigenico sia intracellulare.
Questo é il mio primo post. Un saluto a tutti!  |
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ape18
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 13 marzo 2008 : 20:00:09
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| oddiooo!!! |
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ape18
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 13 marzo 2008 : 20:02:33
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oddiooo! cosa succede se invece di diluire l'anticorpo primario in PBS/BSA l'ho diluito in..... ACQUAAAAA?????!!!!! la mia immunofluorescenza è perduta???????
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 14 marzo 2008 : 03:24:11
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Beh, considerando che il tessuto è fissato le cellule potrebbero non essere esplose... nel qual caso io farei un po' di lavaggi in pbs e rifarei l'incubazione col primario e BSA.
Citazione:
la glutaraldeide, in particolare, non é proprio indicata per l'immuno
Noi la usiamo sui tessuti da guardare al microscopio elettronico, ma non ti so dire il motivo esatto. |
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betsim76
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 14 marzo 2008 : 12:14:54
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Ovviamente non é una bella cosa sostituire il PBS con l'acqua deionizzata, ma non é la fluorescenza ad esserne danneggiata, bensì l'integrità strutturale del tessuto. Diciamo che lo stress osmotico a cui é soggetto dovrebbe essere "tamponato" dalla fissazione, ma é sempre meglio evitare certe sviste.
Per quello che riguarda la glutaraldeide, é un fissativo molto buono e preserva ottimamente la morfologia, per cui é adattissima per indagini ultrastrutturali. E' poco penetrante, per cui si raccomandano campioni di piccole dimensioni. E' un ottimo fissativo per le proteine (da cui la buona resa morfologica) ma agisce per denaturazione, per cui la specificità antigenica si va a far benedire. E' possibile un parziale recupero attraverso digestione enzimatica, ma se si può farne a meno é meglio. Infatti, in indagini morfologiche al TEM la sua concentrazione é spesso simile a quella della paraformaldeide, ma quando si deve effettuare una immunocitochimica, allora viene ridotta molto (anche di 10 volte): un compromesso tra resa della reazione e mantenimento della ultrastruttura.
Scusate la noiosa "lezioncina", ma spero di esservi stato utile... |
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ev
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2008 : 13:34:30
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| la immunoistochimica è una tecnica adatta per vedere se cellule transfettate esprimono la proteina desiderate purchè questa non venga secreta altrimenti la devi andare a cercare nel surnatante (ovvio). piuttosto che immunocitochimica ti consiglio l'immunofluorescenza, se è su una proteina di membana non serve neanche che fissi le cellule, incubi a 4° e non hai problemi di smascheramento dell'antigene. se è intracitoplasmatica ci sono ottimi protocolli di fix & perm. le colture hanno meno problemi dei tessuti. devi però coltivarle su vetro...e questo può aprire una ulteriore discussione... |
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immunofluorescenza
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