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lucialucia
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 26 febbraio 2008 : 10:38:23
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Ciao a tutti!
Dovrei fare un western blot per vedere se la mia proteina si associa con altre proteine e quindi quanti omo/eterodimeri può formare.
Se ho capito bene per per potere individuare più bande dovute ai vari eterodimeri dovrei fare una corsa senza denaturare il lisato cellulare? In pratica come si fa? Ho letto che devo eliminare il mercaptoetanolo dal laemmli buffer per non distruggere i dimeri, ma devo comunque bollire i campioni?
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2008 : 14:45:40
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| scusa darkene, tu normalmente usi questo protocollo per separare monomeri da dimeri/multimeri? |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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lucialucia
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2008 : 14:58:05
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Grazie per il protocollo, ma io sono all'inizio con i western e non ho le idee troppo chiare...
nel protocollo che mi hai dato ci sono un sacco di ricette per i buffer (uno per l'anodo e uno per il catodo..??). Io per un western classico ho sempre fatto la corsa in un running buffer di tris-glicina-SDS caricando i campioni in laemmli buffer (Tris HCl-SDS-glicerolo-mercaptoetanolo-blu bromofenolo). Per lasciare la proteina in forma nativa basta che cambi il loading buffer?
Grazie e scusa se non ci capisco molto... |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2008 : 16:42:04
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il protocollo che ti ho dato è per fare una western bidimensionale, cioè fai una prima corsa in condizioni native, poi tagli la lane d'interesse, la giri di 180° e la fai correre in un altro gel in condizioni denaturanti (cioè con l'SDS).
ovviamente devi avere l'attrezzatura adatta per farla.
se vuoi solo fare una corsa in condizioni non denaturanti, sinceramente non l'ho mai fatta, ma penso non devi mettere nè l'SDS nel gel e nel buffer, nè il beta-bercapto. ma ti ripeto non l'ho mai fatta, quindi non so come viene.
una corsa del genere ti da indicazioni sul peso molecolare del complesso, dal quale puoi derivare se è in omo o etero dimero.
prova a dare un'occhiata qui:
http://www.ap-lab.com/native_gels.htm |
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western blot su eterodimeri
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