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Autore

Discussione

sady
Nuovo Arrivato

Prov.: Venezia
Citt�: Maerne

1 Messaggi

Inserito il - 04 marzo 2008 : 18:51:39

ciao a tutti, qualcuno sa indicarmi qualche metodo di estrazione delle proteine, o dove andarli a cercare?
grazie

valia
Moderatore

Prov.: UK

1001 Messaggi

Inserito il - 04 marzo 2008 : 20:26:25

Guarda se questi link ti sono utili:

http://www.molecularlab.it/protocolli/showprot.asp?cat=10
http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/

Luca-DNA
Nuovo Arrivato

Prov.: Torino
Citt�: Torino

68 Messaggi

Inserito il - 04 marzo 2008 : 20:30:29

Puoi usare tamponi di lisi come EB, RIPA, NP40...
Praticamente se hai le cellule in piastre, aspiri il terreno, lavi bene con PBS (io in genere faccio 2 lavaggi con PBS per togliere bene le proteine del siero che poi ti andranno ad invalidare la quantificazione degli estratti), e poi sulla piastra asciutta aggiungi il tampone di lisi.
Lasci agire un po' il tampone e poi usi uno screaper per staccare le cellule...
Poi raccogli tutto in eppendord e lasci in agitazione per almeno 15 minuti (meglio mezz'ora...) in modo tale da lisare bene le cellule. Alla fine chiarifichi il lisato, centrifugando a max velocit� per almeno 15 minuti (meglio mezz'ora), prelevi il surnatante e lo trasferisci in una nuova eppendorf (il surnatante contiene le proteine estratte mentre il pellet i residui delle membrane e detriti cellulari).
In alternativa all'uso dello screaper si pu� anche staccare le cellule con tripsina, raccogliere tutto in un falcon, centrifugare e risospendere il pellet con PBS, centrifugare nuovamente e risospendere il pellet con PBS, centrifugare e risospendere il pellet con tampone di lisi...lasciare in agitazione e poi chiarificare il lisato e raccogliere il surnatante in una nuova eppendorf.
In questi metodi � importante stare in ghiaccio in tutti i passaggi e centrifugare con centrifughe refrigerate per non degradare il lisato e per non attivare le fosfatasi (anche se si possono aggiungere inibitori per le fosfatasi, cos� come per le proteasi).

A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin)