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tyler
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
 Inserito il - 13 marzo 2008 : 16:50:58
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Ciao a tutti! Sono nuovo sul forum e vi scrivo perchè ho urgentemente bisogno di un consiglio da esperti...
Sono alle prese con una doppia immunoistochimica, diretta da una parte contro un marcatore di membrane e dall'altra con un marcatore nucleare. I singoli protocolli danno un antigen retrieval diverso per i due (uno con buffer citrato e calore, l'altro con acido citrico e calore. Ora, le mia domande in merito...
1) dopo aver fatto il primo antigen retrieval e tutta la prima IHC, devo fare anche il secondo antigen retrieval o il primo da solo basta per entrambi?
2) fare un antigen retrieval con calore mi rovina il segnale della prima IHC?
3) sul protocollo dell'IHC verso l'antigene nucleare, dovrei usare il triton, che però nonso che effetti potrebbe avere sul mio segnale del marcatore di membrana(anche se ormai è già legato)
Vi ringrazio, scusate ma è davvero una questione urgentissima
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betsim76
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 13 marzo 2008 : 17:18:05
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Provo a risponderti io:
1)Tampone citrato e acido citrico potrebbero essere intesi come la stessa cosa (a volte vengono chiamati in entrambi i modi, anche se è non proprio chimicamente corretto). Quello che importa é il pH di riferimento. Ora, siccome mi ci sono imbattuto spesso, ti dico che i pH maggiormente usati sono 6, 2 e 10. Solitamente non esiste una grande differenza di resa (é più importante il calore del pH o della componente chimica del tampone), ma il pH basico é usato più che altro in casi specifici di solito evidenziati nel data sheet degli anticorpi. Il pH acido spesso lo si ottiene con HCl, più che con l'acido citrico. Prova a vedere se nel tuo protocollo é richiesto un pH specifico. Altrimenti mi sento di consigliarti un unico ciclo con tampone citrato pH 6.0 valido per entrambe le IHC. L'importante é che la temperatura raggiunga i 100 gradi.
2)No, perché devi fare un solo trattamento, e, da quello che scrivi, é consigliato per entrambi gli antigeni, per cui nessun problema.
3)Ecco, su questo aspetto potrei avere maggiori perplessità. Non vorrei che il detergente ti andasse a danneggiare le membrane al punto da alterarti il primo segnale... Non ho mai fatto una doppia con un antigene di membrana. Se dovessi notare qualche problema nella resa finale prova a ridurre la concentrazione del tensioattivo o a sostituirlo con uno meno aggressivo del Triton (io uso il Tween allo 0,3%)  |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 13 marzo 2008 : 19:28:22
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sul punto 3 vorrei rassicurarti, io ho usato il triton per fare un double staining per una proteina integrale di membrana e per actina e non ho avuto alcun tipo di problema.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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tyler
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 13 marzo 2008 : 19:51:03
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Grazie mille!!
I due buffer sono leggermente diversi, ma il pH è 6 per entrambi per cui un unico trattamento di retrieval dovrebbe andare bene per entrambe allora...
Per il triton al limite proverò direttamente con una concentrazione un po' più bassa rispetto al protocollo di base, oppure semplicemente seguirò il protocollo...
Grazie ancora!!!!!!!!! |
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tyler
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2008 : 13:59:39
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Volevo solo ragguagliarvi sui risultati...la doppia è effettivamente venuta...piccolo consiglio per i posteri...non usate dab rossa e dab marrone insieme...a leggere i risultati si impazzisce... :P
btw, alla fine il triton non l'ho proprio messo |
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betsim76
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 28 marzo 2008 : 13:50:39
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Siccome non ho mai fatto delle doppie immuno con rilevamento enzimatico, avevo alcune domande per te:
1) Dici che hai usato la DAB rossa... sei sicuro che sia proprio DAB e non un altro substrato della perossidasi di colore rosso?
2) Se il colore rosso é troppo vicino al bruno della DAB classica, perché non operare con un altro substrato (tipo il 4-cloro-1-naftolo, che invece é sul nero-blu)? Oppure potresti usare enzimi diversi (Beta galattosidasi, o fosfatasi alacalina, con substrati che danno colori un po' più distanti)
3) Se non vuoi cambiare reagenti, hai provato a fare l'intensificazione alla DAB bruna e usare l'altro substrato rosso? Se venisse darebbe maggiore contrasto cromatico. Unico dubbio... l'intensificazione potrebbe annerire (il fondo é sempre presente) il resto del tessuto...anche se non conosco nessuno che l'abbia tentato. Dubito di essere il primo ad averci pensato, per cui un motivo ci sarà. |
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tyler
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2008 : 12:38:27
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Citazione:
sicuro che sia proprio DAB e non un altro substrato della perossidasi di colore rosso?
sinceramente non saprei...è probabile tuttavia...
Citazione:
e il colore rosso é troppo vicino al bruno della DAB classica, perché non operare con un altro substrato (tipo il 4-cloro-1-naftolo, che invece é sul nero-blu)? Oppure potresti usare enzimi diversi (Beta galattosidasi, o fosfatasi alacalina, con substrati che danno colori un po' più distanti)
ho chiesto ad alcuni colleghi più esperti di me e mi hanno detto che il problema della colorazione con il blu (sempre indicata generalmente come "dab blu" ma vedi il punto 1) è che tende a svanire come segnale abbastanza velocemente, mentre a me serviva una cosa più stabile, per questo mi hanno consigliato l'accoppiata rosso/marrone...
per il resto del discorso, alla fine abbiamo deciso di adottare una soluzione diversa, vale a dire fare le singole IHC e la morfologia in paraffina e la doppia farla come fluorescenza in tessuti congelati...con mia somma gioia, visto che tagliare al criostato lo trovo mooolto più difficile che farlo al microtomo |
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