Western blotting non-riducente

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nicogy77
Nuovo Arrivato

6 Messaggi

Inserito il - 09 novembre 2005 : 14:56:33

Ciao a Tutti!!
Spero che qualcuno abbia una soluzione al mio problema:
Ho appena sviluppato un W.B. in cui i campioni sono stati fatti correre in condizioni non riducenti; l'anticorpo primario usato è un monoclonale anti VEGF che dovrebbe riconoscermi tutte le forme di VEGF:la dimerica legata all'eparina (46KDa) e anche le monomeriche.
Il problema è che nella lane del campione non wild tipe ma trasfettato con VEGF di 165 aa quindi 19,17 KDa ottengo una banda a 38 KDa. La mia domanda è :
Quello che vedo è la forma dimerica (19,17 per 2 è circa 38)senza l'eparina..ed inoltre il fatto che non legato all'eparina è dovuto al fatto di aver lavorato in condizioni non riducenti????
Vi prego aiutatemi ho bisogno di interpretare questo dato!!!
Grazie a tutti

chick80
Moderatore

Città: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 09 novembre 2005 : 20:28:53

Normalmente quando la tua proteina puo' fare oligomeri e' normale vedere piu bande, quindi quello che vedi e' probabilmente il dimero. Ovviamente le bande sono piu' marcate se lavori in condizioni non riducenti.
Quando dici che non e' legata all'eparina suppongo che sia perche' non ce l'hai messa? oppure come fai a dirlo?
Potresti strippare le membrane e reincubarle con un ab anti eparina per conferma.

Prova a fare un gel riducente, anche se il tuo anticorpo funziona meglio in condizioni non riducenti, almeno puoi vedere se la banda sparisce o cmq diminuisce.

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