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Dionysos
Moderatore

Citt�: Heidelberg

1913 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2008 : 19:05:19

Ho un bel problemone.

Da circa 6 mesi sto lavorando ad un progetto di silenziamento inducibile
usando un vettore homemade che dirige l'espressione tet-dipendente di shRNA
diretti verso un enzima housekeeping (endogeno in cellule Hela).

Dalla sequenza di due siRNA sperimentalmente efficaci, ho ricavato
e clonato due shRNA corrispondenti in un plasmide homemade di tipo
inducibile (precisamente: presenta un promotore H1 modificato con
l'aggiunta di un elemento tetO). Nonostante il vettore sia gi�
stato largamente utilizzato con successo in letteratura, nel mio
caso non sembra funzionare per nulla!

L'attivit� enzimatica del mio target non vuole saperne di calare
e il suo trascritto non sembra subire variazioni significative
in RT-PCR semiquantitativa, nemmeno dopo transienti in tutte le
salse e neppure dopo selezione di cloni selezionati e quindi
stabilmente integranti il plasmide in questione!!!

Inizio a dubitare del sistema inducibile scelto: utilizzo una
linea cellulare di Hela stabilmente integrante il transattivatore
tTA2, che funziona perfettamente con l'espressione di proteine
diretta da promotori CMV (si spegne a concentrazioni crescenti
di doxaciclina) ma che non sembra fare una mazza col promotore H1
n� in presenza n� in assenza totale di doxaciclina.

Problema: questa cosa DEVE riuscire prima di giugno.

Qualcuno ha un qualche minimo consiglio da darmi?

Volere libera : questa � la vera dottrina della volont� e della libert�
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!

Dionysos
Moderatore

Citt�: Heidelberg

1913 Messaggi

Inserito il - 19 maggio 2008 : 21:42:25

sostanzialmente...nessuno ha mai lavorato con vettori esprimenti shRNA ?

Volere libera : questa � la vera dottrina della volont� e della libert�
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!

paolo865
Utente Junior

Prov.: Como
Citt�: Olgiate Comasco

262 Messaggi

Inserito il - 29 maggio 2008 : 21:41:39

Ho visto clonare un shRna in un vettore usando un piccolo stratagemma:
usare l'inserto non defosforilato e defosforilare solo il plasmide. Non ne ho avuto un esperienza diretta quindi non ti so dire di pi�...
ciao

Dionysos
Moderatore

Citt�: Heidelberg

1913 Messaggi

Inserito il - 30 maggio 2008 : 10:01:26

Beh � uno stratagemma abbastanza comune per il clonaggio plasmidico.
Fortunatamente il clonaggio mi � andato bene: la cosa problematica
� l'espressione!

Volere libera : questa � la vera dottrina della volont� e della libert�
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!

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