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lucialucia
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 16 maggio 2008 : 17:06:44
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Ciao a tutti!
Vorrei fare un WB partendo anzichè da lisato cellulre da un supernatante di coltura (che ho già concentrato).
Avete esperienza e qualche protocollo? A idea mia aggiungerei 5 microlitri di sample buffer 5x a 20 microlitri di supernatante (il massimo che riesco a caricare nei miei pozzi sono 25-30 microlitri) e poi bollirei i campioni per 5 minuti, ma non riesco a trovare conferme in letteratura. Aiutatemi!
Lucia
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2008 : 18:00:54
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| Western Blot ne ho fatto uno su un lisato...Però concettualmente potresti usare lo stesso protocollo anche da un supernatante di coltura...Noi abbiamo purificato una proteina di fusione da un supernatante e si sarebbe anche potuto fare un WB... |
 
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2008 : 20:01:29
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d'accordo con schuldiner86. L'unico passaggio critico, diverso da un wb classico su lisato, secondo me è la concentrazione del surnatatnte. che tecnica hai usato? di getto direi una concentrazione di proteine con TCA...
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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lucialucia
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2008 : 10:05:26
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Grazie Iside.
per la concentrazione ho usato il sistema centriprep della millipore, che fa concentrare le proteine sopra 10kDa di circa 15x.
Secondo voi dovrei aggiungere degli inibitori delle proteasi al mio sup? e dovrei fare un dosaggio Bradford per sapere quante proteine caarico (si può fare con RPMI????)
Grazie.
Lucia |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2008 : 17:28:28
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non conosco il sistema che hai usato tu. io aggiungerei comunque gli inibitori delle proteasi e farei sicuramente il dosaggio delle proteine e la normalizzazione prima di fare il western. inoltre non credo che avrai problemi allo spettrofotometro usando l'RPMI, usalo anche per il bianco e poi azzeri.
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2008 : 21:32:54
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Sconsiglio vivamente di usare il TCA: ho avuto notevoli
problemi con il ristabilimento del pH (non puoi caricare
un pellet pieno di TCA su SDS-PAGE: la migrazione ne risente)
Anche quei sistemi di concentrazione che hai usato sono
difficili da standardizzare: piuttosto immunoprecipita,
che vai sul sicuro.
Io ho avuto problemi di interferenza con la misurazione
spettrofluorometrica, per cui assolutamente usa un bianco
contenente l'RPMI, come ti dice Iside. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2008 : 21:40:09
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
piuttosto immunoprecipita,
che vai sul sicuro.
assolutamente d'accordo. sarebbe sicuramente la soluzione più "pulita". |
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lucialucia
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2008 : 11:55:34
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ho provato a concentrare il supernatante e poi a fare un immunoprecipitato.
Sto studiando una proteina dimerica ma tra lisato cellulare e supernatante mi vengono bande ad altezze completamente diverse... vi è mai successo? è possibile che dopo l'immunoprecipitazione e la bollitura dei campioni per staccare le biglie di sefarosio le due subunità si possano riassociare formando anche degli omodimeri?
HELP please!!! |
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WB da supernatante di coltura
Didattica e Relazioni
