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Discussione |
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dr zoidberg
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
 Inserito il - 21 luglio 2008 : 17:52:53
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Salve a tutti
mi servirebbe di sapere se qualcuno di voi ha mai usato secondari dell'amersham/ge healthcare rabbit e mouse in soluzione con BSA? io ho sempre usato latte a 5% non vorrei trovare qualche sorpresa, io ho usato un primario in bsa e ho bloccato in BSA sono indeciso se usare latte o BSA...? help me
grazie in anticipo
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«Vivi come se dovessi morire domani. Impara come se dovessi vivere per sempre.»
Gandhi |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 18:07:53
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| se hai bloccato in BSA penso ti convenga continuare così! |
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 19:23:04
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| mmm...il datasheet non ti dice niente?io ho sempre usato latte..anche se per il secondario io lo faccio 1%..come penso anche io come darkene che devi continuare in BSA.. |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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pistilin
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
9 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 19:50:32
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ciao,
io uso i secondari amersham...e ho provato tutte le combinazioni...
bloccato in BSA e secondario in milk normale...oppure bloccato in BSA e anke secondrìari in BSA....differenze?
pokissime.....solo un po piu pulito il fondo del filtro....
l' unico consigli? sempre primario in BSA....
spero esserti stata utile
ciao |
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 21:15:05
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| perchè sempre primario in BSA??in teoria dovrebbe darti più fondo e aspecifici dopo..no? |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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swiss_redfox
Nuovo Arrivato
Città: Lausanne
12 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 22:20:46
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| Concordo con Nyo84 ... perchè il primario in BSA? Io uso sempre primario e secondario (2dario Sigma) sempre in latte 3-5% e nn ho mai avutoproblemi di fondo e/o aspecifici! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2008 : 03:42:44
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Secondo me non tra latte e BSA non cambia una cippa.
Ah forse una cosa sì: il prezzo. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2008 : 14:52:12
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| visto che si parla di western..per sviluppare usate l'ECL Advanced della GE?in caso,non vi ha mai dato problemi di segnale?? |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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dr zoidberg
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2008 : 17:26:51
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Grazie a tutti è andata bene con il secondario in BSA, cmq io finora ho sempre usato latte se nn espressamente richiesto da datasheet dell'anticorpo, infatti per questo ho incubato il primario con BSA questa volta...
per nyo84 io ho sempre usato ECL e nn mi ha mai dato particolari problemi, l'ho usato anche scaduto funziona lo stesso... ciao a tutti |
«Vivi come se dovessi morire domani. Impara come se dovessi vivere per sempre.»
Gandhi |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 22 luglio 2008 : 17:59:42
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L'ECL advance è fortissimo. il segnale è ingestibile (a me 1 secondo di esposizione va a saturazione) e il fondo è sporchissimo. ho risolto diluendo l'ECL advance 1:10 in Tris-HCl 50 mM pH 8. in questo modo ho segnali più forti dell' ECL normale ma gestibili!
altrimenti prova l'ECL Plus, che è intermedio |
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2008 : 00:40:31
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mmmm..il fatto è che a noi a volte scompare il segnale di punto in bianco..non capiamo il perchè..succede a random..proverò a diluirlo magari..ma in pratica lo diluisci dopo aver mischiato i due boccettini??
e,un'altra domanda,cosa usate per sviluppare?intendo in termini pratici..camera oscura con le lastre?sviluppatrice automatica??altro?
grazie |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2008 : 11:19:35
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per tornare un attimo al discorso del milk/BSA, se non espresso chiaramente sul data-sheet, io li uso a seconda della proteina che sto cercando, nel senso che per le fosfo-forme uso il milk perchè la BSA potrebbe interferire con il segnale (non è legge, anzi, a volte ho blottato per fosfoproteine in BSA e mi sono venute benissimo) e il milk lo uso per tutti gli alri tipi di ab. per il blocking, non ho nessun problema quando faccio il blocco in milk e il primario in BSA e il secondario di nuovo in milk o viceversa...in generale preferisco il blocco in milk ma in alcuni casi ho anche bloccato con milk5%+BSA1% così mi tolgo ogni pensiero!
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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swiss_redfox
Nuovo Arrivato
Città: Lausanne
12 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2008 : 14:01:08
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Citazione:
Messaggio inserito da nyo84
mmmm..il fatto è che a noi a volte scompare il segnale di punto in bianco..non capiamo il perchè..succede a random..proverò a diluirlo magari..ma in pratica lo diluisci dopo aver mischiato i due boccettini??
e,un'altra domanda,cosa usate per sviluppare?intendo in termini pratici..camera oscura con le lastre?sviluppatrice automatica??altro?
grazie
Noi usiamo l'ECL (né Plus né Advanced) regolarmente senza alcun problema! le uniche vv in cui nn ho avuto segnale sono state:
- qdo ho diluito il 2dario in milk con NaN3 ... ehm...ero al mio 2do WB, poi ho imparato in fretta! 
- qdo qcno di un altro lab ha sbagliato a preparare le soluzioni x la sviluppatrice automatica che usiamo in comune...da strozzarlo! 
Se nn sei in nessuni di qsti casi: sei sicuro che il tuo transfer abbia funzionato bene? hai provato a colorare la membrana con Ponceau S subito dopo il transfer?
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2008 : 14:46:53
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sì sì..il fatto è che noi a volte non vediamo nemmeno i marker...adesso che abbiamo cambiato metodo di sviluppo i problemi succedono meno spesso,ma quando prima sviluppavamo ancora a mano,era un terno al lotto..
per curiosità: che ricetta usate per TBS-Tween?
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Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2008 : 16:49:27
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Citazione:
Messaggio inserito da nyo84
per curiosità: che ricetta usate per TBS-Tween?
NaCl 150 mM
Tris pH 7.5 50 mM
tween 0.1%
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 23 luglio 2008 : 17:29:39
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Il nostro ha:
Tris 20 mM
NaCl 137 mM
Tween 0.1%
HCl 0.016%
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Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
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swiss_redfox
Nuovo Arrivato
Città: Lausanne
12 Messaggi |
Inserito il - 29 luglio 2008 : 15:41:43
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Citazione:
Messaggio inserito da nyo84
sì sì..il fatto è che noi a volte non vediamo nemmeno i marker...adesso che abbiamo cambiato metodo di sviluppo i problemi succedono meno spesso,ma quando prima sviluppavamo ancora a mano,era un terno al lotto..
per curiosità: che ricetta usate per TBS-Tween?
mmmm.... quindi il tuo problema è legato allo sviluppo e nn tanto alle fasi precedenti!
TBS? Noooo trp lungo da preparare, bisogna tamponare il TRIS! qui in svizzera siamo grezzoni ...e usiamo PBS 1x con Tween 0.1% ...mai avuti problemi!  (salvo qlli citati prima, ma di sicuro nn dovuti al tampone!)
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 luglio 2008 : 17:59:22
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| Io usavo alternativamente BSA o latte, a seconda dell'anticorpo. Con alcuni il background veniva più pulito col latte con altri con BSA, ma si tratta di piccoli cambiamenti. Alla fine buona parte del latte è albumina quindi... |
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BSA e Secondario Western Blotting
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