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Topogigio77
Nuovo Arrivato
Città: Milano
37 Messaggi |
 Inserito il - 25 luglio 2008 : 09:34:10
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Ciao,
in un forum si parlava di pre-amplificazione e mi è stato chiesto di mettere anche in questa sezine il protocollo. Ecco qua:
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_042472.pdf
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_042471.pdf
In due parole in cosa consiste la pre-amplificazione:
- hai poco cDNA per fare tutti gli esperimenti che ti servono? 
- hai cDNA di pessima qualità (es: estrazione RNA da paraffinato, biopsie, microdissezioni etc.)? 
- hai geni pochissimo espressi e quindi ti escono a Ct indecenti (dal 35 in poi...a volte anche MOLTO in poi)? 
PROBLEMA FINALMENTE RISOLTO! 
in pratica basta avere un pizzico di cDNA (se non nerro si parla anche di 1 solo ng!), lo si arricchisce prima di fare la Real Time ed il gioco è fatto. L'arricchimento è fenomenale: si pre-amplifica non tutto il cDNA come ad esempio avviene nell'IVT (è ormai noto che vengono sballati i rapposrti di espressione, alcuni tratti vengono arricchiti più di altri), ma si preamplifica utilizzando gli stessi saggi TaqMan oppure gli stessi primers (per chi lavora in SYBR) che poi verranno utilizzati in Real Time.
Ovvero: si fa un pool di questi saggi TaqMan / primers (fino a 100 contemporaneamente, in multiplex!), 10 cicli di PCR di pre-amplificazione, si diluisce (meraviglia delle meraviglie, quanto cDNA che si ottiene!) e si carica per la classica Real Time.
Risultato: mediamente si guadagnano circa 6 Ct rispetto ad un non-preamplificato.
Io non ci credevo, me l'hanno fatta provare e ora appena è minimamente necessaria la uso.
Costicchia un po' (se non erro sui 1000 euro a listino per una cinquantina di pre-amplificazioni) ma se penso a quante volte dovevo rifare gli esperimenti prima per ottenere qualcosa di minimamente decente mi sa tanto che ci guadagno ancora...
ciao! 
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Pre-Amplificazione del cDNA
Didattica e Relazioni
