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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
 Inserito il - 02 agosto 2008 : 01:55:39
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ciao
antefatto: sto lavorando sulla co-immunoprecipitazione di diverse proteine di un complesso X, e riesco a identificarle abbastanza bene tramite IP e SDS-PAGE + immunoblot. Esempio:
-IP per proteina A, WB per proteina A, WB per proteina B
-IP per proteina B, WB per proteina B, WB per proteina A
problema: dovrebbe essere molto semplice a questo punto colorare un gel, tagliare la banda specifica (cioe' non presente nel controllo negativo) del peso molecolare appropriato, e identificare la proteina usata come esca per la IP tramite spettrometria di massa.
Finora non ci sono riuscito.
Credo che il motivo sia che non posso concentrare come vorrei il campione... perche' piu' di 50 microlitri nei pozzetti non ci entrano.
Ho anche provato a fare eluizioni sequenziali o a usare il cross-link ma niente.
Suggerimenti?
(se non sono stato chiaro ditelo)
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 04 agosto 2008 : 05:21:34
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nessun suggerimento???
quando si fa una IP in genere si fa l'eluizione finale aggiungendo il Laemmli Sample Buffer e si fanno bollire i campioni per 5 minuti. Come potrei fare a concentrare dei campioni che sono disciolti in quel particolare buffer??? |
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manuela.piazzi
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
8 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2008 : 17:14:26
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Ciao!
Da quanto materiale sei partito nel tuo co-ip?
Di solito, quando voglio colorare in Coomassie un'ip e poi excidere la banda per MS/MS utilizzo almeno 1.5 mg di lisato di partenza, altrimenti con Coomassie non si colora niente....o meglio niente che possa poi essere identificato...
Alternativa è colorare con Silver stain MS compatibile che è molto + sensibile (se non hai abbastanza materiale).
Non si riesce a concentrare una volta che hai eluito in quel buffer, che sappia io.
Altra alternativa è utilizzare vetri di spessore 1.5mm anzichè 1 (per l'SDS page), così puoi caricare anche + di 80 uL di eluato (diciamo così)
Spero di non averti incasinato le idee ulteriormente!
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2008 : 20:16:59
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no no, anzi! hai centrato il problema.
Attualmente sto usando 1 mg di partenza.
Ho provato a usare il silver staining, ma il risultato e stato contaminare il gel... che come sai deve essere privo di polvere e cheratina. E poi mi e' stato detto che e' meglio il coomassie e che se si vede la banda col coomassie si e' in grado di identificare la proteina.
Comunque, visto che non si puo' concentrare una volta nel Sample buffer, ho anche provato a eluire tre ip uguali in modo sequenziale, cioe' usando lo stesso buffer... ma niente.
In effetti non avevo pensato ai gel da 1.5... solo che li compro pronti perche' li uso a gradiente e ora valuto un po'... potrebbe valerne la pena... |
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2008 : 23:46:27
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no... non ho trovato nessuna azienda che venda gel a gradiente precast con pozzetti da piu' di 50ul...
e non li posso fare io perche' altrimenti li contamino... |
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manuela.piazzi
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
8 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2008 : 14:36:40
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Ciao!!!
Ehm.... io ho smesso di usare i gradientati.... mi sono venuti tutti malissimo! hanno avuto una variabilità di corsa pazzesca (almeno nei miei casi  ), per cui mi sono ritrovata con gel tutti strisciati 
Ho risolto definitivamente il problema, usando, dove possibile, gel non gradientati (anche ricorrendo ai midi-gel) e facendomi i gradientati in casa!!!!!!!!!!
Per excidere, ti consiglio di andare sotto cappa sterile, usare tutto autoclavato e prima di excidere risciacquare il gel con acqua sterile almeno un paio di volte, sotto cappa (facendo così, la mia massista è stata molto felice, dato che non ho ancora le camere isolate apposta per spottare o lo spot picker)...
in bocca al lupo!!!!! |
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2008 : 20:51:16
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si si ovviam lavoro sotto cappa e uso tutto pulito... (ecco perche' non voglio usare gel fatti a mano...)
Ma i risultati non vengono... e non si capisce perche'. Se vedi la proteina col western blot come e' possibile non trovarla con il mass spect?
Inizio a credere che i "criteri di identificazione" del mass spect facility dove porto i campioni siano un tantino ristretti... |
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2009 : 10:39:36
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Citazione:
Messaggio inserito da byo_gio
ciao
antefatto: sto lavorando sulla co-immunoprecipitazione di diverse proteine di un complesso X, e riesco a identificarle abbastanza bene tramite IP e SDS-PAGE + immunoblot. Esempio:
-IP per proteina A, WB per proteina A, WB per proteina B
-IP per proteina B, WB per proteina B, WB per proteina A
problema: dovrebbe essere molto semplice a questo punto colorare un gel, tagliare la banda specifica (cioe' non presente nel controllo negativo) del peso molecolare appropriato, e identificare la proteina usata come esca per la IP tramite spettrometria di massa.
Finora non ci sono riuscito.
Credo che il motivo sia che non posso concentrare come vorrei il campione... perche' piu' di 50 microlitri nei pozzetti non ci entrano.
Ho anche provato a fare eluizioni sequenziali o a usare il cross-link ma niente.
Suggerimenti?
(se non sono stato chiaro ditelo)
io suggerisco di vederti un pò di bibliografia.... |
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2009 : 19:47:22
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Citazione:
io suggerisco di vederti un pò di bibliografia....
ah va bene scusa il disturbo,
allora possiamo anche chiudere il forum.
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2009 : 18:11:27
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ho solamente risposto come hai fatto tu in un altra discussione.
comunque mi sembra che tu ne sai troppo di biologia molecolare; complimenti! |
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H2O
Nuovo Arrivato
32 Messaggi |
Inserito il - 24 marzo 2009 : 18:21:04
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| byo_gio, da quanto ho letto sei anche tu un cervello in fuga? dove lavori per l'esattezza? magari siamo anche vicini di stato |
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IP & mass-spect
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