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elisabetta strafella
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
 Inserito il - 19 settembre 2008 : 18:11:53
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Per poter valutare se un tossico ha avuto effetto sulle cellule come dovrei ottenere i risultati in un saggio MTT?
grazie
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2008 : 10:22:30
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Dai materiali e metodi della mia tesi 
Saggio di proliferazione cellulare mediante MTT
Il saggio di proliferazione cellulare mediante MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio bromide) è un metodo semplice per la determinazione del tasso di crescita delle cellule. Il test con MTT si basa sulla riduzione intracellulare dei sali di tetrazolio da parte dell'enzima mitocondriale succinato deidrogenasi (SDH) in cristalli di un prodotto bluastro denominato formazano. La reazione pertanto può avvenire solo nelle cellule metabolicamente attive e il valore della densità ottica (O.D.), ottenuta mediante lettura spettofotometrica, può essere correlata al quantitativo di cellule vitali presenti.
Le cellule delle linee di glioblastoma xxx sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a fondo piatto, alle concentrazioni rispettivamente di xxx cellule per ml di terreno (devi considerare per quanto tempo porti avanti l'MTT, nei pozzetti da 96 non c'è molto spazio e se nel frattempo il tuo non trattato va in overconfluenza poi falsi il risultato). Le cellule sono state risospese in DMEM al 10% di siero e aliquotate in un volume di 100µl per pozzetto. (...) Come controllo positivo dell’attività citotossica degli inibitori è stata usata la linea SU-DHL1 di ALCL (perchè io utilizzavo un inibitore contro la tirosinchinasi ALK, ma anche nel tuo caso dovresti avere una linea su cui sicuramente il tuo farmaco funziona per potervi rapportare l'effetto sul tuo campione).
La somministrazione degli inibitori (...)è avvenuta il giorno successivo alla messa in coltura. I farmaci sono stati somministrati nell’intervallo di concentrazioni che va da 400 nM a 6,25 nM, ottenute diluendoli serialmente di un fattore 2.
Per la rilevazione della vitalità cellulare, una soluzione di MTT (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania) 5mg/ml in DPBS è stata dispensata 25#956;l per pozzetto e lasciata incubare 4 ore a 37°C al buio in incubatore. In seguito le piastre sono state pellettate centrifugandole a 2000 rpm per 10 minuti e il surnatante completamente aspirato. Il formazano è stato poi solubilizzato grazie alla somministrazione di 100#956;l a pozzetto di DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania ).
La vitalità cellulare è stata determinata mediante misurazione dell’O.D. a 550 nm utilizzando il lettore ELISA Microplate Reader Model 550 (Bio-Rad). I dati sono stati ottenuti con il programma Microplate Manager 4.0 e analizzati mediante Excel. Per ogni condizione di ogni esperimento è stata effettuata una semina in quadruplicato, quindi dai valori di O.D. ottenuti è stato ricavato un valore medio che è stato normalizzato sul non trattato, la cui O.D. è stata valutata pari a 100.
In pratica in questo modo puoi costruirti una curva in cui l'O.D. del non trattato è 100 e le altre in percentuale, in modo da valutare chiaramente la tua IC50, se vi è correlazione dose-risposta ecc.
se hai bisogno di qualche consiglio più specifico per il tuo caso chiedi pure
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Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2008 : 10:23:34
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| scusa dove non si legge c'è scritto ul si vede che non riconosce il carattere |
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elisabetta strafella
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2008 : 18:01:54
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Grazie mille!!
volevo chiederti un chiarimento,che intendi per semina in quadruplicato?in ogni piastra hai seminato 4 pozzetti per ogni concentrazione di tossico? oppure hai fatto 4 piastre in tempi diversi?inoltre volevo saper è sempre necessario avere un controllo positivo?ossia una linea cellulare in cui il tossico ha un chiaro effetto di morte?
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elisabetta strafella
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
 Inserito il - 20 settembre 2008 : 18:12:48
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| Per normalizzare intendi sottrarre i valore dei O.D di ogni trattato al valore del non trattato? |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2008 : 20:49:54
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Intendo che ho seminato 4 pozzetti per ogni dose, cmq non è detto che tu debba fare in quadruplicato per forza, possono essere di+ o di meno, per comodità mia per ogni concentrazione ho seminato 4 pozzetti, in modo da avere 4 valori di O.D. su cui fare la media (il che ovviamente è molto meglio, soprattutto per non avere deviazioni standard troppo alte, se non hai i valori tutti omogenei). Per ogni singolo esperimento ho sempre fatto una singola piastra, a diversi time point. Quindi avevo es. 4 piastre (24, 48, 72, 96 ore)ciascuna contenente 4 pozzetti uguali per il non trattato, 4 per la concentrazione 6,25 nM dell'inibitore, 4 per 12,5 nM ecc. Normalizzare forse non è il termine migliore intendo cmq rapportare il valore di un trattato al valore, posto 100, del non trattato per ottenere la diminuzione percentuale.
Per fare questo usi la formula O.D. trattato *100/ O.D. non trattato.
es. non trattato = 1.113, lo poni come 100. Il tuo trattato alla x concentrazione mostra una O.D. di 0,230? 0,23*100/1,113= 20,66% del non trattato
Non so per cosa tu debba fare l'MTT, io dovevo necessariamente avere un controllo positivo perchè l'inibitore da noi e su quelle linee non era mai stato usato. Devi avere un'idea di quello che ti aspetti come effetto, magari sennò sul tuo target c'è un effetto ma non sai in che misura. Però dipende anche da cosa usi se in letteratura non c'è nulla a cui aggrapparti non è che puoi inventarti chissà che |
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elisabetta strafella
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2008 : 18:22:41
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Grazie mille.
I tuoi chiarimenti mi sono molto utili.
Ho seminato anche io come hai fatto tu.
Ora cercherò di analizzare i risultati secondo anche i tuoi suggerimenti.
Ancora grazie!!!!
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2008 : 23:40:03
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| La-Fra ma non ti conviene passare all'MTS? Secondo me il passaggio di apsirazione con l'MTT genera tanto errore... cmq anche io "normalizzo", come sopra riportato, quando faccio 'sti esperimenti. |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2008 : 19:30:14
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| si in effetti hai ragione alexo ma l'MTT è l'unica cosa a disposizione in lab e mò mi tocca usare quello in linea di max ho sempre fatto uno a uno i wells del glio (gran sbatti) perchè col fondo piatto si rischia di aspirare cellule, mentre col burkitt usavo well-plate con fondo a U, lì con la multicanale non ho mai avuto grandi problemi ma non so se lasciando cmq quei pochi ul di terreno si alterano i valori..l'MTS come funzia? |
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Eugy
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2014 : 21:05:01
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ciao la_fra..
ho letto le tue dettagliate descrizioni riguardo MTT test..ascolt auna domanda al volo..come ricostituisci l'MTT?
NEL SENSO IO DEVO AGGIUNGERE 250MICROLITI DI MTT 1mg/ml in PBS...?
visto che è la prima volta che lo faccio...l'mtt è un solvente..una polvere??..
grazie mille |
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sicial
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
14 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2015 : 23:59:53
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| Riprendo questo post per chiedervi come avete fatto la deviazione standard per un test MTT. Mi spiego meglio, ho fatto un esperimento in triplice (3 repliche per ogni condizione). Per ogni condizione ho ottenuto 3 assorbanze, ho fatto la media e ho calcolato la DS con excel. Per esprimere la "% vitalità cellulare" ho fatto (abs trattato media/abs controllo media)*100. Ora la domanda, se imposto un grafico a istogrammi dove sull'asse x ho tutte le condizioni e sull'asse y la % vitalità cellulare, come posso riportare la DS? La DS che ho calcolato è relativa all'assorbanza, come posso metterla riferendomi alla % di vitalità cellulare? Non so se mi sono spiegato bene, non è facile. Spero che qualcuno possa aiutarmi. Grazie mille! |
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saggio MTT
Didattica e Relazioni
