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asgard1988
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 22 novembre 2012 : 09:13:58
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Ciao, avevo una piccola domanda da porre.
Sto studiando un composto che provoca la morte di cellule cancerogene. In particolare cellule di leucemia mieloide acuta.
Guardando le immagini che ho postato qualcuno saprebbe dirmi se si riconosce qualche segno di una particolare morte cellulare (apoptosi, necrosi, autofagia).
La prima foto è di cellule non trattate, la seconda di cellule trattate per dieci minuti con tale composto.
Grazie a chiunque possa indirizzarmi.
Michele
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
 Inserito il - 23 novembre 2012 : 17:00:53
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| Hai qualche immagine presa ad un diverso intervallo di tempo? |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2012 : 17:13:02
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| Quelle piccole protuberanze molto più evidenti nella seconda foto potrebbero essere dei blebs di cellule in apoptosi? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2012 : 17:14:39
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| Per quello chiedevo qualche immagine in più, da quella fornita mi ritroverei a lanciarmi unicamente in wild guesses. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Caffey
Utente Attivo
Città: Perugia
1496 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2012 : 18:44:13
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Anche secondo me si tratta di apoptosi. Anche quegli addensamenti presenti all'interno delle cellule sono un elemento tipico dell'apoptosi delle cellule leucemiche.
Inoltre anche la deframmentazione di una cellula praticamente al centro dell'immagine fa proprio pensare ad un fenomeno apoptotico.
E comunque non credo si possa escludere da questa immagine la presenza di fenomeni autofagici.
Uno striscio colorato con MGG sarebbe molto più chiaro. Non si può fare?
Per non parlare di colorazioni specifiche o immagini al TEM ma forse è eccessivo!
In realtà ci vorrebbe un esperto in materia! 
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[...] Hunc igitur terrorem animi tenebrasque necessest
non radii solis neque lucida tela diei
discutiant, sed naturae species ratioque. [...]
Titus Lucretius Carus |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2012 : 19:06:36
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| In ogni caso dovrai fare marcaggi per entrambe le cose... quindi comincia a guardare i marker classici apoptotici (e.g. caspasi3, Bax, Bcl2 etc) |
Sei un nuovo arrivato?
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Caffey
Utente Attivo
Città: Perugia
1496 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2012 : 20:05:28
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
In ogni caso dovrai fare marcaggi per entrambe le cose... quindi comincia a guardare i marker classici apoptotici (e.g. caspasi3, Bax, Bcl2 etc)
Ah ecco!
Non sono molto esperto di vita di laboratorio ma era a questo cui mi riferivo con l'espressione "colorazioni specifiche".
Dai che qualcosa ci capisco anche se farò il medico!! Mi sento soddisfatto! |
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Titus Lucretius Carus |
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maross
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2012 : 21:35:42
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| esistono anche dei kit elisa per valutare la presenza di nucleosomi citoplasmatici...per le cellule che crescono in aderenza è possibile anche, con questi kit, discriminare fra apoptosi e necrosi...dovrebbe esistere qualcosa di analogo anche per cellule in sospensione. Sennò potresti in prima istanza fare un DAPI e valutare...nell'apoptosi si ha condensazione a zolle della cromatina e quindi con il DAPI si vedono degli spot con colorazione molto più intensa. Poi come hanno già detto esistono una serie di marker molecolari, anche per l'autofagia, tipo LC3... |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2012 : 22:55:25
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| La tecnica principe per valutare se le cellule sono in apoptosi è il TUNEL, è abbastanza semplice da fare ed esistono dei kit belli che pronti. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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maross
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2012 : 08:45:35
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| sì è vero, anche se so che ad alcuni il tunel ha dato problemi (forse dipendeva dal tipo di cellule, non saprei)...io quando l'ho fatto l'ho trovato facile. Poi ovviamente dipende da che informazioni vuoi avere: con un ELISA hai anche un dato quantitativo. Però magari prima di comprare qualsiasi kit, può farsi un'idea anche con un banalissimo DAPI, per poi orientarsi sul saggio più idoneo alle sue esigenze. |
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Moloney
Nuovo Arrivato
111 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2012 : 17:55:47
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Con una lettura in propidio ioduro, puoi riconoscere se hai degli eventi ipodipoloidi e cominciare a pensare all'apoptosi, se avete un citofluorimetro. Tra le altre tecniche che sfruttano la citofluorimetria, sicuramente c'è la detection dell'annexin V, sempre specifica per l'apoptosi.
Sinceramente i blebbings non si vedono facilmente al microscopio invertito e inoltre 10 minuti mi sembrano veramente molto rapidi per essere un'apoptosi avanzata così massiva... mi sembra più una velocità da necrosi. |
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asgard1988
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 26 novembre 2012 : 15:12:02
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Allora......
Le due immagini che ho messo mostrano le cellule dopo 24H. Come si può vedere la situazione non cambia molto.
In quanto a marker apoptotici il mio dubbio sorge proprio da quelli.
In quanto per la caspasi 3 (WB, trattamento a 2H) non vedo il relativo taglio ma la sua sparione completa, stessa cosa per caspasi 8, e PARP.
Inoltre trattando con un inibitore pancaspasico (Z-VAD)non noto alcuna differenza nella morte.
Ho usato pure un kit per discriminare tra apoptosi e necrosi della Roche basato sulla rilevazione dei nucleosomi, ma questo mi ha dato dei risultati inconcludenti, anche con tempi di trattamento molto brevi, dieci minuti. (questo probabilmente a causa di una distruzione dei nucleosomi, in quanto in WB a dopo dieci minuti di trattamento l'istone H3 sparisce del tutto).
TUNEL e citofluorimetro non sono a mia disposizone attualmente.
Più tardi metterò un immagine delle cellule trattate in immunofluorescenza e colorate con l'HOEST. Cosi potrete notare la mancanza di cromatina condensata a zolle.
Grazie a tutti!
Michele
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asgard1988
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 26 novembre 2012 : 15:26:35
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 Scritto da MolecularLab Mobile
La caspasi 9 non la caspasi 8. Scusate. |
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maross
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2012 : 21:29:04
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Citazione:
Ho usato pure un kit per discriminare tra apoptosi e necrosi della Roche basato sulla rilevazione dei nucleosomi, ma questo mi ha dato dei risultati inconcludenti, anche con tempi di trattamento molto brevi, dieci minuti. (questo probabilmente a causa di una distruzione dei nucleosomi, in quanto in WB a dopo dieci minuti di trattamento l'istone H3 sparisce del tutto).
"risultati inconcludenti" in che senso? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2012 : 02:41:52
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| Concordo con Obarra e tutti coloro che ti consigliano la TUNEL per verificare che si tratti di apoptosi. In alternativa, potresti effettuare una immunofluorescenza su active caspase3. |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2012 : 10:27:31
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| Hai provato con una colorazione con MDC (monodansilcadaverina) per evidenziare la presenza di autofagia? |
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Discussione |
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Apoptosi o autofagia? Di che morte muoiono queste cellule?
