Sequenziamento

Qualsiasi processo di sequenziamento si compone di diverse fasi:
1. preparazione DNA stampo, sequenziamento con marcatura --> serie di frammenti. con un'estremità fissa e una variabile,
2. separazione (elettroforesi ad alta risoluzione in condizioni denaturanti),
3. rilevazione frammenti di DNA,
4. lettura della sequenza.

1^a reazione - sequenza e marcatura:
Consente di ottenere un set di frammenti, marcati solo su una delle 2 eliche, che hanno una loro estremità uguale, e l'altra estremità variabile di un solo nucleotide (tra un frammento e l'altro c'è solo una base di differenza). Per separare questo frammento si usa o elettroforesi su gel o elettroforesi capillare: i frammenti devono migrare solo in base al MW (peso molecolare), ecco perché è l'elettroforesi usata è denaturante. Nella ultima fase di lettura, abbiamo metodi come l'autoradiografia (marcatura radiattiva), o la reazione con i fluorocromi (marcatura a fluorescenza).
Abbiamo due metodi: chimico (Maxam e Gilbert) e enzimatico (Sanger, dei terminatori di catena o dei dideossi) entrambi messi a punto nel 1977. Il chimico è più laborioso e meno automatizzabile, l'enzimatico è stato via via ottimizzato.
Lo schema generale di una reazione di sequenza (per entrambi i metodi):
si parte da un campione ds di DNA, si fa in modo di ottenere dei campioni ss che hanno un'estremità fissa, da questo si ottengono 4 sottocampioni, ciascuno dei quali è un mix di oligo che terminano con un nulceotide preciso: un sottocampione terminerà con C, uno con G, uno con T, uno con A.

METODO CHIMICO:
La prima reazione consente di marcare* radioatt solo uno dei segmenti, ora teniamo solo la parte *, quindi compiano una reazione che ci permetta di rompere il frammento marcato solo in corrispondenza delle G (reazione parziale --> avere tutti i possibili frammenti che terminano con G). Si usa il dimetilsolfato, che modifica molto la G, così con la reazione successiva la piperidina elimina la base e, partendo dal sito abasico (senza base) taglia il legame fosfodiestere.

G → DMS             |
C → Idrazina + NaCl | → + piperidina
G+A → Ac. Formico    |
T+C → Idrazina        |

Il passaggio comune in tutti i casi è la reazione con la piperidina, ora le 4 mix oligo nucl devono essere separate (SDS-PAGE), quindi seguirà un'autoradiografia, e dopo lo sviluppo della lastra vedremo una cosa di questo genere. Da questo punto ricostruiremo la sequenza.

METODO enzimatico di SANGER.

Per far avvenire la reazione si usa un' enzima, la DNApol. Si parte dal campione a doppia elica, si utilizza un piccolo (20 bp) nucleotide che viene usato da primer: l'innesco è necessario per far partire la DNApol e iniziare la reazione di polimerizzazzione. Naturalmente, siccome le DNApol sintetizzano nella direzione 5' -->3', il primer dovrà avere un estremità 3'-OH libera che sarà quella da cui partirà la polimerizzazione. Dobbiamo porre nella mix di reazioni diversi dNTP, che consentono di sintetizzare il nuovo filamento. Il primer deve avere estremità 3'-OH libera perché nel corso della polimerizzazione i nucleotidi vengono aggiungo all'estremità 3'OH del nucleotidi precedentemente inserito. Per far sì che la reazione di polimerizzazione si interrompa in punti precisi suddividiamo il campione in quattro sottocampioni e in ognuno di questi metteremo nella mix di reazione anche dei dideossinucleotiditrifosfato (ddNTP) ovvero i terminatori di catena. Questi non presentano il gruppo OH sul C3' ribosio, quindi una volta inseriti sul filamento nacente bloccano la reazione della polimerasi, e la reazione si bloccherà in corrispondenza del ddNTP inserito. La concentrazione dei ddNTP sarà tale che non in tutti i punti questi vengno inseriti, come nel caso del metodo chimico: la reazione deve essere parziale. Il risultato sarà sempre quello di avere un mix di nucleotidi che terminano in tutte le posizioni in cui sullo stampo era presente una T (o una A, G, C). Contemporaneamente a questa reazione si farà avvenire anche la reazione di marcatura. Per il metodo chimico si utilizza solo la marcatura radioattiva, per quello enzimatico funziona anche la marcatura a fluorescenza.

Volendo riassumere.

- Non ci sono interferenze da parte di alcune strutture secondarie che si possono formare sul DNA da sequenziare;
- Non è necessario utilizzare un innesco (primer);
- Consente di sequenziare anche oligo piuttosto piccoli.
- È più accurato

- È molto laborioso (doppio trattamento per ogni sottocampione);

- Difficoltà nell'automatizzazione;

- Bassa risoluzione.

- Reagenti tossici

- Richiesta maggior quantità di DNA.

- Ogni sottocampione è trattato una volta sola, quindi essendo meno laborioso è anche più rapido;
- Più facilmente automatizzabile;
- Si possono esaminare più campioni contemporaneamente;
- Miglior risoluzione.
- Minori richiesta di DNA

- La polimerasi, nel caso in cui dovesse incontrare strutture 2arie (forcine) si blocca e si può staccare dallo stampo. Questo causa degli oligo con estremità non deossi (falsi stop) e causano la lettura di una base inesistente.
- Subcloning in vettori
- Accuratezza legata all'enzima utilizzato

I vantaggi del metodo enzimatico rispetto al chimico hanno fatto sì che questo metodo si sviluppasse sempre più, permettendo oggi anche il sequenziamento passivo di interi genomi.