È un’analisi sui prodotti, e i dati
sono ancora di più. Si sta cercando di farla anche sul 2
hybrid sistem. Bisogna fare tutte le fusioni con il dominio di attivax
e con il dominio di legame, e poi mettere in piedi un sistema di
screening, --> analisi a tappeto.
In questo caso, invece del chip abbiamo elettroforesi bidimensionale.
Il primo problemino è che non vendono elettroforesi bidimensionali
rappresentative di un certo organismo.
Ho una collezione di cellule, devo estrarre le proteine in modo
ri-pro-du-ci-bi-le, e farci un elettroforesi bidimensionale. In
commercio ci sono strisce dove sono già presenti immobiline
con gradienti di pH, mentre una volta uno doveva farsele da solo.
In genere si usa un gradiente di pH abbastanza ampio, anche se si
perdono cmq quelle proteine molto basiche che sono le proteine ribosomali.
Faccio avvenire la corsa e ho una strisciolina con le proteine separate
in base al punto isoelettrico. La strisciolina viene quindi depositata
su una lastra di gel (c’è una fessura al posto dei
pozzetti), e faccio il solito SDS-PAGE con separazione in base al
MW. I gel quindi vengono o colorati con il Nitrato d’Argento,
che è molto più sensibile del Coomassie, visto che
mi interessa scovare proteine poco presenti, oppure blotto il gel
e ci faccio un immunodecorazione ecc…, quindi il gel viene
messo in un sistema automatizzato (che costa una cifra) che prende
la spot e la isola. E siccome 700 milioni non me li dà nessuno,
lo faccio manualmente. Questa è l’analisi di primo
acchito. Quando poi vado ad approfondire facendo il focusing di
una singola zona, vedo che uno spot è fatto da n proteine,
con n = 200. Ora entrano in gioco tecniche Maldi-Tof (spettrometria
di massa) o anche elettrospray, e questi metodi permettono di arrivare
alla sequenza dei singoli peptidi. E una volta che uno ha la sequenza
la prima cosa che fa è andare in banca dati, e se è
fortunato trova già la proteina, altrimenti si va a cercare
il gene ecc… La tecnica è ancora meno utilizzata del
GeneChip.
Quindi siamo passati da tecniche che permettono l’analisi
di un ristretto n° di geni a tecniche che in un singolo esperimento
permettono di ricavare informazioni da un intero genoma.
Dall’inizio fino ad ora, abbiam fondalmentalmente
visto alcune tecniche di base che servono per quella disciplina
che prende il nome di Ingegneria Genetica. Di fatto ci siamo interessati
a giochicchiare con i geni: gli abbiamo clonati, mutati, sequenziati,
espressi…
Ma la biotecnologia non è solo questo.
In genere tutte queste tecniche vengono applicate ad altre 2 grosse
branche che forse un giorno vedremo:
L’ingegneria proteica e l’ingegneria metabolica.
Ingegneria Proteica.
Oggetto: proteine
Le proteine vengono ingegnerizzate, serve per studiare i rapporti
fra struttura e funzione di una proteina.
Cambiando una Cys, in quel punto la prot. non mi fa più ponti
disolfuro, quindi cambia la struttura e vado a vedere questo cosa
comporta alla funzione;
Posso modificare una proteina al fine di aumentare la capacità
di purificarla;
Posso modificare al specificità di substrato;
Posso cambiare la KM;
Posso renderla più stabile (più termostabile).
Ingegneria Metabolica.
Io sono in grado di modificare il metabolismo di un certo organismo.
E creare come risultato finale quelle che i giornali chiamano “sostanze
OGM”.
Per esempio:
Modificax del pathway della glicolisi. L’acido lattico è
un prodotto importante in ambito industriale, sotto vari campi (in
campo farmaceutico è usato come aggiungoitivo, usato come
precursore di materiale pseudoplastico biodegradabile). In genere
sono i batteri a produrlo, ma se il pH si abbassa troppo in cultura,
i batteri crescono male (leggi: rese ridotte). Se al fermentatore
aggiungo soda o bicarbonato, il pH si alza, ma invece di avere ac.lattico
io ottengo il sale (lattato). Quindi devo poi purificare il lattato
ed estrarre dal sale l’acido (leggi: aumento dei costi e diminuizione
del valore aggiunto del prodotto che voglio vendere).
L’idea qual è stata?
Ci sono organismi, come Cerevisiae, che crescono benissimo a pH
= 2-3, ma di lattato, con la glicolisi normale, il lievito non vuole
saperne. Cosa faccio? Vedo il metabolismo di Cerevisiae e cerco
di hackerare il sistema. L’acido lattico si può produrre
dal Pyruvato, ma ci vuole la latticodeidrogenasi, che non è
di serie con S.Cerevisiae.
Va bene trasformare il lievito ed aggiungergli il gene per la PyrDH,
ma se non agisco anche sulle altre vie, non è che il il pyr
non si trasforma in glc! Se non inattivo la PDC, questa stronza
continuerà a rubarmi $$$! Si è visto che il lievito
sopporta bene l’inattivazione della PDC e della PDH, (anzi,
procedendo con la One Step Distruction si è visto pure che
gli enzimi non erano codificati da un gene solo, ma da q.che gene).
Ed alla fine, si è riusciti ad ottenere ac.lattico, che tra
l’altro attraversa le membrane e si riversa nel medium di
coltura.
