Il metodo spettrofotometrico sfrutta la capacità degli acidi nucleici di assorbire la luce UV con un massimo di assorbimento ad una lunghezza d'onda di 260 nm, lo spettro di assorbimento varia da 230 nm a 280 nm.

Acido Nucleico	Concentrazione con assorbimento unitario (µg/ml)
dsDNA	50
ssDNA	37
RNA	40
Oligo	30

Esempio di lettura della concentrazione allo spettrofotometro per dsDNA:

Impostare lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 260 nm.

1. In una cuvetta di quarzo porre 1ml di acqua (bianco) e azzerare lo strumento (il volume può variare in base alla capacità della cuvetta).
2. Preparare una cuvetta di quarzo contenente 996ul di H₂0 e aggiungere 4ul della soluzione di dsDNA (diluizione 1:250). E' possibile anche utilizzare diluizioni differenti, a seconda della situazione.
   
3. Coprire con parafilm e miscelare capovolgendo delicatamente la cuvetta.
4. Introdurre la cuvetta nello spettrofotometro e leggere l'assorbanza (A) a 260 nm e 280 nm. (in alcuni spettrofotometri molto vecchi è necessario impostare manualmente le lunghezze d'onda e leggere prima a 260 e poi a 280)
   
5. Coi risultati ottenuti, calcolare la concentrazione di DNA sapendo che in una cuvetta con un cammino di 1 cm, il DNA a doppio filamento alla concentrazione di 50µg/ml ha un assorbimento di 1 a 260nm:
   
   

   Concentrazione DNA (ug/ml)=A260nm		50ug/ml
   		1 Unità assorbimento

   
   
6. Per risalire alla concentrazione iniziale della soluzione moltiplicare il valore ottenuto per il fattore di diluizione (250 o quello scelto al passaggio 2)

Il procedimento è identico per la lettura di ssDNA, RNA o Oligo ma bisognerà utilizzare gli appropriati valori di "Concentrazione con assorbimento unitario" riportati in tabella.

Per determinare la purezza dell'acido nucleico vengono utilizzati i seguenti rapporti:

• rapporto A260/A280 = indice della contaminazione da proteine
  Per in DNA il rapporto deve essere 1.6-1.8 mentre per l'RNA 1.8-2.0, rapporti superiori indicano una contaminazione da proteine.

• rapporto A260/A230 = indice della contaminazione da carboidrati e fenoli (solventi)
  il valore ottimale di questo rapporto e di circa 2.2, rapporti inferiori indicano contaminazione da solventi

E' possibile utilizzare anche la lunghezza d'onda di 320nm come background: a questa lunghezza d'onda non assorbono né acidi nucleici né proteine quindi l'assorbanza dovrebbe essere zero. Comunque deve essere il 5% della assorbanza a 260nm altrimenti vuol dire che il campione (o la cuvetta) è molto sporco e non è possibile fare una lettura accurata. Il valore di assorbanza a 320nm deve essere sottratto agli altri valori di assorbanza.

 

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