Estrazione di RNA da cellule eucariotiche
Descrizione
La quantità di RNA varia tra tessuti e tipi cellulari diversi.
Per l’estrazione di RNA occorre utilizzare molte precauzioni per evitare che agiscano le RNasi che sono presenti un po’ ovunque e degradano le molecole di RNA. Queste precauzioni sono: ovviamente indossare i guanti, utilizzare punte, eppendorf e falcon sterili ovvero autoclavate, inoltre trattare con un po’ di alcool anche le pipette da utilizzare, mettere sotto cappa chimica della nuova carta argentata per evitare che le RNasi precedentemente presenti possano degradare i campioni di RNA che vogliamo ricavare dalle cellule.
Consiglio
Lavorare sotto cappa.
Aggiungere 500 µl di Trizol in ciascuna eppendorf contenente il pellet di cellule, vortexare e aspettare 15 minuti a RT.Aggiungere 100 µl di cloroformio, agitare vigorosamente con le mani per 15 secondi e lasciare a RT per 2-3 minuti. Centrifugare a 4°C per 15 minuti a 12000rcf. Trasferire in eppendorf nuove solo la fase acquosa aspirandola dal menisco, facendo attenzione a non prelevare le fasi sottostanti che invece vanno buttate.Aggiungere 250microl di isopropanolo, agitare e lasciare in ghiaccio per 10 minuti, in alternativa si può conservare o/n i campioni nel -20°C.Centrifugare per 10 minuti a 4°C a 12000rcf, poi mettere le eppendorf in ghiaccio e rimuovere il sopranatante. Aggiungere al pellet 0.5mL di etanolo al 75%.Centrifugare a 12000rcf per 5 minuti a 4°C.Rimuovere il surnatante e far evaporare l'etanolo residuo mettendo l'eppendorf contenente il pellet o in camera calda o sotto la lampada, per circa 30 minuti.Quando si nota che l’etanolo si è ormai seccato aggiungere, al pellet di RNA, 40 µl di acqua distillata (meglio ancora se Nuclease free water), risospendere e conservare nel -20°C. Dopo si può quantizzare con lo spettrofotometro. Il rapporto di OD260/OD280 vicino a 2 indica che l'RNA ha un buon grado di purezza.
