PureLink™ Total RNA Blood
Descrizione
la tecnica consiste nella purificazione dell'RNA totale da sangue intero necessario per la successiva RT-PCR e PCR. Io la trovo di ottimo livello, per la quantità e qualità di RNA estratto, oltre ai costi contenuti ed ai tempi ristretti.
PURIFICAZIONE total RNA con metodo PureLink (INVITROGEN)
PureLink™ Total RNA Blood Purification Kit For isolating total RNA from whole blood
Catalog no. K1560-01
I reagenti inclusi sono sufficenti per realizzare 50 isolamenti
Lysis Buffer (L3) 17.5 ml
Lysis Buffer (L5) 175,0 ml
Wash Buffer (W4) 60,0 ml
Wash Buffer (W5) 10,0 ml
RNase-free water 5,0 ml
Spin Cartridges with Collection Tubes 50
Wash Tubes (2.0 ml) 50
Elution Tubes (1.7 ml) 50
Il Kit di purificazione di RNA totale da sangue intero PureLink è qualificato dal punto di vista funzionale isolando l’ RNA totale da 200 µl di sangue intero umano come descritto in questo manuale e deve fornire i seguenti risultati:
OD260/280 fra 1.6-2.2
Il Kit di purificazione di RNA totale da sangue intero PureLink permette la purificazione di RNA totale di alta qualità da 50-500 microl da sangue intero fresco di mammifero
Arricchimento dei Leucociti
1.In un tubo sterile e RNAsi-free di formato adatto, aggiungere 5 volumi del buffer di lisi (L5) a 1 volume (da 50 a 500 μl) del campione fresco di sangue
2. Incubare per 10 minuti in ghiaccio. Vortexare il tubo brevemente 2-3 volte durante l'incubazione. La soluzione sarà traslucida.
3.Centrifugare il tubo a 4°C per 10 minuti a 400 x g. Rimuovere il surnatante completamente. Non scartare il pellet poiché contiene i leucociti.
4. Risospendere il pellet dei leucociti in 2 volumi del buffer di lysis (L5). Mescolare bene vortexando brevemente.
5.Centrifugare il tubo a 4°C per 5 minuti a 400 g. Rimuovere il surnatante completamente. Non scartare il pellet perché contiene i leucociti. Continuare immediatamente a punto 6.
6.Risospendere il pellet dei leucociti in 350 µl del buffer di lysis (L3). Miscelare bene vortexando brevemente per risospendere il pellet accertandosi dell’ l'assenza di qualsiasi agglomerato di cellule.
7.Aggiungere 350 µl di etanolo al 70% al tubo e mescolare bene vortexando brevemente. Continuare alla procedura di purificazione.
Procedura di Purificazione
A.Rimuovere dal pacchetto una cartuccia di separazione in un tubo dell’eluato. Trasferire il lisato dei leucociti ottenuti nel punto 7, nella cartuccia di separazione.
B.Centrifugare la cartuccia di separazione a 8.000 × g per 1 minuto alla temperatura ambiente.
C.Scartare l’eluato e reinserire la cartuccia di separazione nel tubo della separazione.
D.Lavare la cartuccia di separazione con 700 µl del buffer di lavaggio (W4). Centrifugare a 8.000 × g per 30” alla temperatura ambiente.
E.Effettuare l'operazione facoltativa di digestione con dnasi) se necessario per eliminare DNA genomico continuare a punto F.
F.Lavare la cartuccia di separazione con 500 µl del buffer di lavaggio (W4). Se la digestione della dnasi I fosse realizzata, incubi per 5 minuti alla temperatura ambiente. Dopo centrifughi a 8.000 × g per 30 secondi alla temperatura ambiente. Scarti l’eluato.
G.Lavare la cartuccia di separazione con 500 µl del buffer di lavaggio (W5) con etanolo. Centrifugare la cartuccia a 8.000 × g per 30” alla temperatura ambiente.
H.Ripetere il punto G una nuova volta.
I.Scartare l’eluato e disporre la cartuccia di separazione nel tubo e centrifugare a 8.000 x g per 1’ alla temperatura ambiente per rimuovere tutto il buffer di lavaggio residuo (W5).
J.Disporre la cartuccia di separazione in un tubo pulito di eluizione da 1.7-ml.
K.Elure con 30-100 μl di acqua sterile e RNAsi-free. Aggiungere l'acqua al centro della cartuccia ed incubare alla temperatura ambiente per 1’.
L.Centrifugare la cartuccia di separazione a 8.000 × g per 1 minuto alla temperatura ambiente. Il tubo di eluizione contiene il vostro RNA totale purificato. Rimuovere e scartare la cartuccia.
M.Stoccare l’ RNA totale a -80°C o usi il RNA totale per l'applicazione downstream voluta.
