Separazione dei granulociti
Descrizione
Il protocollo consiste nella separazione selettiva dei granulociti
METODICA PER LA SEPARAZIONE SELETTIVA DEI GRANULOCITI
1. Prelievo eparinato di 10 cc di sangue (non utilizzare eparina se si deve procedere a PCR)2.diluire 1:1 il sangue con PBS o Soluzione Fisiologica3.In una Falcon da 15 ml stratificare lentamente 3,5 ml di sangue intero su 3,0 ml di Ficoll-Hipaque Mono-Poli Resolving Medium (M-RPM)4.Centrifugare a 1600 rpm per 30'Nella provetta alla fine dei 30' si osserveranno 4 frazioni a. Plasma b. Linfomonociti c. Neutrofili d. EritrocitiTra le tre ultime frazioni è contenuta una regione contenente M-RPM5.Eliminare delicatamente, con pipetta Pasteur di vetro, il plasma e i linfomonociti6.prelevare i granulogiti neutrofili con pipetta Pasteur di vetro e depositarli in altra Falcon da 15 ml7.Lavare i neutrofili, per due volte con PBS pH 7,6, centrifugando, ogni volta, a 1800 rpm per 5'-10'8.Risospendere il pellet, per 5" in 1 ml di dH2O, allo scopo di rompere gli eritrociti, eventualmente ancora presenti. Bloccare la reazione di lisi con 1 ml di soluzione fisiologica (shock osmotico)9.Centrifugare le cellule per 5'-10' con PBS a 1800 rpm. Ripetere il passaggio 2 volte10.Risospendere i neutrofili in 1 ml di RPMICONTA delle CELLULE1)Porre in una eppendorf 450 µl di liquido di Turk + 50 µl di sospensione cellulare2)Prelevare circa 20 µl di soluzione ed inserire nella camera di Burker 3)Contare le cellule in quattro quadranti4)Effettuare la media (N1+N2+N3+N4/4)5)Effettuare questo calcolo:MEDIA x 200 (fattore della camera) x 1000 (volume finale)
