Immunocitochimica (ICC)
Descrizione
Questa tecnica permette di confermare la presenza di una proteina in cellule in coltura e di determinare la posizione a livello cellulare.
Partire da cellule cresciute su vetrini, oppure pipettare 100-200 µl di sospensione cellulare su di un vetrino da microscopio e incubare a 37ºC o/n.Aspirare il medium di coltura e sciacquare delicatamente con PBS, facendo attenzione a non disturbare troppo le cellule.Trattare con fissativo ghiacciato per un minuto. Si possono usare diversi fissativi, il risultato dipende dal tipo cellulare.
I fissativi più comuni sono:
1% paraformaldeide in PBS
95% etanolo / 5% acido acetico
50% etanolo / 50% metanolo
AcetoneSciacquare delicatamente le cellule due volte per 5 minuti con PBSTrattare le celllule con 8% BSA in PBS per 1 ora a TA in una camera umidificata per prevenire il disseccamento delle cellule.Lavare 2 volte per 5 minuti con PBSRimuovere gentilmente l'eccesso di PBS e trattare con l'anticorpo primario per la proteina cercata diluito in 1% BSA in PBS. Incubare per 2-4 ore a TA.Lavare 3 volte per 5 minuti con PBSRimuovere gentilmente l'eccesso di PBS e trattare con l'anticorpo secondario coniugato con fluoresceina diluito in 1% BSA in PBS. Incubare per 1-2 ore a TA al buio in camera umidificata.
Alternativamente è possibile utilizzare altri tipi di anticorpi secondari (es. coniugati a perossidasi). Ulteriori passaggi possono essere necessari in quel caso.Lavare 3 volte per 5 minuti con PBS al buioMontare il vetrino ed esaminare al microscopio a fluorescenza.Tradotto e parzialmente modificato dal sito di Upstate
