Colorante (loading dye) per agarosio
Descrizione
Sono le modalità per preparare in laboratorio, a partire dalle polveri, il colorante per colorare l'amplificato, che verrà fatto correre in gel d'agarosio.
MATERIALE OCCORRENTE
15% FICOLL 400 7.5g0.03%XYLENE CYANOL FF 30mg=0.03g0.03% BLU DI BROMOFENOLO 30mg0.4% ORANGE G 40mg0.5 M EDTA 5ml (conc. finale 50 mM)TE pH 7.5 45ml 50ml volume finaleIstruzioni:
Mettere in un becker sterile con un magnetino sterile: 30ml di TE, aggiungere 7.5g di FICOLL 400 (si formeranno dei grumi strani), mettere a bassa agitazione e riscaldare a bassa temperatura, chiudendolo con l’alluminio ( il parafilm si rompe), aggiungere anche 5ml di EDTA 0.5M.
Dopo che si è sciolto il FICOLL ( fare attenzione che non si abbrustolisca), pesare le polveri , ognuna in una vaschetta.
Dopo aver messo le polveri pesate in una Falcon da 50ml, aggiungere i 15ml di TE restanti (sempre con una falcon ed una pipetta da 1000 μl), alle vaschette di pesata delle polveri, in modo da recuperare il residuo delle polvere rimasto nelle vaschette, versare quindi anche la soluzione di FICOLL scaldata nella falcon.
Mettere ad agitare per alcune ore la Falcon, quindi filtrare con filtri 0.45 µm (Minisart della SARTORIUS) sterili ed una siringa da 10ml. Cambiare filtrino ogni 10ml (occorrono in totale 5 filtri, una siringa ed una Falcon nuova in cui filtrare la soluzione finita).
Attenzione le polveri sporcano molto!!!
BANDA DELL’ ORANGE G : gialla 50bp
BANDA DEL BLU DI BROMOFENOLO : blu 300bp
BANDA DELLO XYLENE CYANOL: violetto 4000bp
Risoluzione del gel in base al% di agarosio
%GEL (range in bp)
0,3 60.0000-5000
0,6 20.000-1000
0,7 10.000-800
0,9 7000-500
1,2 6000-400
1,5 4000-200
2,0 3000-100
NB=per frammenti più piccoli, o se vuoi confrontare frammenti che differiscono di poche bp, usa i gel di poliacrilamide invece che quelli di agarosio.
Le quantità sono state prese dal Maniatis
