preparazione di E.Coli competenti
Descrizione
é un metodo rapido ad alta efficienza per ottenere colture di e.coli
PASSAGGIO IMPORTANTE
é fondamentale lavorare in sterilitàPartitre da E.coli TOP10, BL21, JM109, XL1 blue, DH1, DH5 o MM294Prendere una colonia singola da una piastra precedentemente incubata a 37° per 16-20 ore e trasferire in 2ml di LB broth in un tubo ventilato da 13mlIncubare a 37°C O7N in agitazione (300cycles/min)prelevare 0.5ml della coltura e inocularli in 50ml di Medium A in una beuta da 500ml
medium A : LB broth addizionato di:
MgSO4*7H2O 10mM
glucosio 0.2%
(il glucosio funge da fonte addizionale di C assieme al Mg++ stimola l'efficienza di trasformazione)Incubare a 37°C in agitazione(300cycles/min)fino alla fase logaritmica media. La concentrazione batterica non deve superare le 10(alla otto) cellule/ml (OD600-0.3/0.4)Trasferire la coltura in un tubo falcon da 50 ml raffreddata in ghiaccioMettere in ghiaccio per 10minCentrifugare a 1500rpm per 10 min a 4°CEliminare il surnatante e lasciare il tubo falcon invertito per 1min per rimuovere bene il terrenoRisospendere il pellet in 0.5 ml di medium A raffreddato in ghiaccioSe la risospensione avviene a RT l'efficienza di trasformazione diminuisce di 2 ordini di grandezzaAggiungere 2.5ml di storage solution semplice raffreddata in ghiaccio
Storage solution: LB broth pH 7.0 addizionato di:
MgSO4*7H2O 12mM
glicerina 36%
PEG(MW 7500) 12%
Agitare bene senza vortexare e rimettere in ghiaccio
