Materiale occorrente: mice (tra 6 weeks e 6 mesi di vita), siringa da 2ml, ago da 18G, filtri per siringhe da 0.22 μm

Reattivi: terreno completo RMPI 1640, HBSS, PBS1X+EDTA1Mm (filtrato),
.ACK lysis buffer (soluzione ipotonica che lisa le emazie)
condizione: 5 ml per una milza ; 12ml per due milze,
50ml per più milze

Procedura:
-Prendere milza di mice di età compresa tra le 3 weeks e i 6 mesi e inserirla in falcon con HBSS
-Sotto cappa prelevare immediatamente la milza e metterla su una petri con un pò di PBS1X+EDTA1Mm*** (in alternativa di può mettere HBSS)
-Prendere una siringa e con la base dello stantuffo ┴ e disgregare il pezzo
-Una volta pronto prendere una siringa da 10 ml e con ago 18G fare su e giù per omogenizzare ulteriormente
-Filtrare con filtro da 0.22 μm in una falcon da 50ml
-Lavare la piastra con HBSS (per togliere residui di milza) e farlo passare nuovamente con filtro da 0.22 μm
-Portare a volume con HBSS facendolo passare sempre attraverso il filtro
-Centrifugare a 1500rpm per 7 minuti
-Eliminare il sovranatante e risospendere il pellet , delicatamente, con 5 ml ACK lysis buffer finchè non diventa torbido-omogeneo
-Lasciare 5 minuti a RT agitando ogni tanto delicatamente
-Dopo portare a volume con HBSS e centrifugare a 1500rmp per 7 minuti
-Eliminare il sovranatante e lavare nuovamente con HBSS centrifugando a 1500rmp per 7 minuti
-Eliminare il sovranatante e risospende delicatamente il pellet all’inizio con 1ml di terreno evitando la formazione di grumi poi aggiungere altri 19ml per un totale di 20ml di terreno completo RPMI
-Conta cellulare ( il range di resa è di 5-15*107 )
.in un pozzetto preparare:
20μl di sospensione cellulare + 20μl di Tripan Blue in un
rapporto 1:1
.contare le quattro file del primo quadrante a sinistra distinguedo le cellule vive (opalascenti)
dalle morte (blu). Sommare le vive esprimere in % le morte (morte:vive+morte = x: 100)