Materiale occorrente:

* piastre da 6 wells
* filtri per siringa da 0.45 μm (or 0.22 μm),

Soluzioni occorrenti:

* antiCD3 [10µg/ml] in 1ml di carbonato/bicarbonato 0.1M pH 9.6
Filtrare con filtro da 0.22µm

* antiCD28 [1µg/ml]

* LPS [1µg/ml]

* condizione: 1milione di cellule/1ml di terreno completo

Procedura:

preparare antiCD3 e aliquotarlo nei rispettivi pozzetti. Segnare su piastra data e ora

Lasciare 1 ora a 37°C in incubatore al 5% di CO2

Finita l’ora lavare, fino a volume, con HBSS (aspirare con puntale sul bordo senza seccare troppo)

Preparare antiCD28 e aliquotarlo direttamente nei pozzetti

Mettere 5 milioni di cellule nel pozzetto (facendo i relativi calcoli per gli ml) rispettando il rapporto 1milione di cellule/1ml di terreno completo 1:1 (indi mettere i restanti 4 ml di terreno completo dato che nel 1ml restante vi sono 1milione di cellule per un totale di 5 ml)

Incubare a 37°C (il tempo dipende dal tipo di stimolo in genere 48 ore)

1) Finita la stimolazione si può saggiare l'espressione di citochine attraverso l'estrazione di RNA:

togliere la piastra dall’incubatore e con puntale da 1000, tarato a 800, spipettare il pozzetto per staccare le cellule dalla piastra

prelevare il tutto e metterlo in una falcon da 15 ml

lavare il pozzetto con 2 ml di HBSS per togliere le cellule rimaste attaccate. Spipettare bene il fondo senza fare bolle e mettere nelle rispettive provette

centrifugare a 1500rpm per 7 minuti a RT

Eliminare il sovranatante e risospendere il pellet con 1ml di PBS e trasferire il tutto in eppendorf da 1.5ml

Centrifugare a 1500rpm (350g) per 7 minuti

Eliminare il sovranatante

Le cellule ottenute vengono trattate secondo protocollo per l'estrazione di RNA

2)Finita la stimolazione si può saggiare la quantità di citichine prodotte attraverso saggio ELISA:

prelevare il sovranatante prendendo 100microl alla volta (per quattro volte) e tenendo il puntale teso sul bordo. Non toccare assolutamente il fondo del pozzetto altrimenti di prendono anche le cellule.

Conservare il sovranatante a -80°C o procedere direttamente con analisi ELISA