Isolamento di LDL dal plasma umano
Descrizione
Le LDL (low density lipoprotein) sono lipoproteine implicate nel trasporto di colesterolo e trigliceridi nella circolazione sanguigna.
Questa tecnica permette l'isolamento di queste proteine dal plasma.
ATTENZIONE: questo protocollo utilizza plasma umano, che può essere potenzialmente pericoloso e trasmettere malattie. Utilizzare guanti lunghi e protezioni per gli occhi.
Giorno 1:Il plasma deve essere stato prelevato non più di 3-4 giorni prima.
Aggiungere a 300 ml di plasma 3 ml di EDTA 100 mM (sterilizzato per filtrazione) in modo da ottenere una concentrazione finale di 1mM. Si possono anche aggiungere inibitori delle proteasi come preservanti.Il plasma viene quindi centrifugato a 12 ºC, 20000 rpm per 20' in un rotore TI-70. Le provette sono rimosse dalla centrifuga e vengono rimossi i chilomicroni che, se il paziente era a digiuno quando è stato prelevato il sangue, dovrebbero essere pochi.
I chilomicroni si troveranno nella frazione bianca in cima alla soluzione.
Eliminare i chilomicroni e trasferire il resto del plasma in altre provette.
Il plasma rimasto (~250 ml) viene quindi centrifugato a 12 ºC, 52000 rpm per 24h in un rotore TI-70, con circa 25 ml per provetta.
Giorno 2:Mischiare il layer inferiore avendo cura di lasciare intatto il pellet (di colore verdognolo). Il pellet contiene glicogeno e fibrinogeno, più trascurabili quantità di LDL. Recuperare questo layer inferiore e buttare il resto.
PASSAGGIO IMPORTANTE
Portare la densità a 1.06 usando bromuro di potassio (KBr). Questo passaggio è indispensabile per far precipitare le LDL. Aggiungere 0.075 g KBr/mL plasma. Per testare la densità pesare 1ml di soluzione. Se non è abbastanza alta aggiungere altro KBr.Centrifugare a 12ºC a 40000 rpm per 48h in un rotore TI-70.
Fermare il rotore e recuperare la frazione superiore, contenente LDL, facendo attenzione a non mischiarla con le altre frazioni.
Consiglio
Le LDL possono essere conservate prima dell'uso fino a 2 settimane a 4 ºC al buio e sotto azoto.
Tradotto da http://qcom.etsu.edu/biochem/protocols/ldl.htm
