Isolamento di mitocondri
Descrizione
Questa tecnica permette di ottenere un estratto mitocondriale da cellule in sospensione.
Centrifugare le cellule per 10' a ~370g. Decantare il surnatante e risospendere le cellule in 10 volumi di buffer NKM.Ripetere il passaggio precedente altre due volte. Risospendere le cellule in 6 volumi di buffer di omogenizzazione.Incubare le cellule in ghiaccio per 10' e omoegeneizzare meccanicamente con un pestello. Controllare al microscopio la rottura cellulare, che deve essere attorno al 60%Versare l'omogenato in una proveta contenente ugual volume di saccarosio 2M e mischiare gentilmente.Centrifugare a 1200g per 5'. Il pellet conterrà cellule intatte, nuclei e grosse impurità. Trasferire quindi il surnatante in un'altra provetta (il pellet si può buttare) e ripetere nuovamente la centrifugazione come al passaggio precedente, trasferire il nuovo surnatante in un'altra provetta.Centrifugare a 7000g per 10'. Il pellet contiene i mitocondri.
Risospendere il pellet in 3 volumi di buffer di sospensione mitocondriCentrifugare a 9500g per 5' per riprecipitare i mitocondri.
Consiglio
A questo punto si può procedere in vari modi a seconda dell'esperimento. Si può direttamente aggiungere loading buffer per western blotting oppure ulteriormente purificare su gradiente di saccarosio etc.
Tradotto da AbCam
