ISOLAMENTO PBMC
Descrizione
Protocollo per l'isolamento di Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC)
ISOLAMENTO PBMC
Collezionare 20 ml di sangue periferico in provette di L-eparinaDiluire almeno 1:2 con soluzione fisiologica (in un tubo da 50 ml sterile)Stratificare DELICATAMENTE sul fondo del tubo 10 ml di Ficoll per preparazioni linfocitarie (Ficoll-Paque)Centrifugare a 1500 RPM per 30’ a temperatura ambiente (RT)Eliminare una parte di siero e recuperare l’anello centrale contenente PBMC, con il restante siero, evitando accuratamente di prelevare il pellet rosso. Porre in un altro tubo da 50 ml sterile.PASSAGGIO IMPORTANTE
D’ora in poi lavorare in ghiaccioLavare due volte con ice-cold soluzione fisiologica e centrifugare a 1500 RPM, 10’ a 4°C (dopo ogni centrifuga eliminare il sovranatante e sbattere il pellet, aggiungere soluzione fisiologica e ricentrifugare)Risospendere in 10 ml di soluzione fisiologica (aggiungere prima 3 ml di sol. Fisiologica e risospendere con pasteur cotonata poi aggiungere altri 7 ml).Dai 10 ml prendere 50 µl + 450 µl di TURK per la lettura nella camera di BurkerCentrifugare a 900 RPM per 10’ a 4° C per allontanare le piastrineRisospendere in medium completo alla concentrazione desiderata
