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Screening dei plasmidi superavvolti Descrizione Il clonaggio genico non sempre è una cosa semplice, soprattutto se il vettore è particolare, l'inserto anche, e la strategia di clonaggio poco vincente. Spesso quindi prima di ottenere il costrutto perfetto occorre fare molti tentativi e quindi molte miniprep per isolare la colonia giusta. Per eliminare a priori le colonie che non contengono il costrutto di interesse mi avvalevo di questa tecnica, che mi consentiva di screenare in poche ore un numero considerevole di colonie (circa 60). Solo per le colonie che risultavano positive a questo test allestivo miniprep. Screening: - Preparare n eppendorf (in base al numero di colonie che si intende screenare) contenenti ciascuna 10 µl di acqua filtrata; - Mettere una piastra con LB-agar + antibiotico selettivo ad asciugare in stufa e successivamente disegnare sulla piastra stessa delle righe orizzontali numerate, tante quante le eppendorf; - Con un’ansa sterile piccare una colonia singola sulla piastra su cui sono cresciute le colonie e stemperare bene nei 10 µl di acqua di una eppendorf; subito dopo fare lo striscio in corrispondenza del numero della eppendorf (*) - Mettere in stufa a 37°C o/n le piastre con gli strisci; - Ad ogni eppendorf aggiungere 10 µl di cracking buffer 2X e far avvenire la lisi per circa 10 minuti Caricare i campioni su gel di agarosio 1 % con n pozzetti. IMPORTANTE: bisogna caricare a secco poiché i campioni sono viscosi e tendono a uscire; si deve mettere nella vaschetta TAE 1X a sufficienza per coprire gli elettrodi e bagnare il gel con un velo di tampone senza assolutamente bagnare i pozzetti. Impostare il voltaggio a circa 80 V. Quando i campioni sono entrati nel gel si può aggiungere il restante tampone. Ricordare di caricare su gel il plasmide di controllo (100 ng), per individuare facilmente i cloni potenzialmente positivi. (*) nel caso in cui si volesse fare subito un pre-inoculo, allestire anche n falcon contenenti 5ml LB + antibiotico selettivo. In queste falcon si stempera l’ansa sterile dopo averla stemperata nell’eppendorf corrispondente ed aver eseguito il relativo striscio.(precisamente: stemperare in acqua, strisciare, stemperare in LB); I pre-inoculi sono quindi lasciati crescere o/n a 37 °C in agitazione a circa 200 rpm. Questi inoculi servono per eseguire le mini-prep. Se non si ritiene opportuno far subito i pre-inoculi (per esempio se ci si attende di avere pochi positivi di cui effettivamente interessi fare la mini-prep), il pre-inoculo può essere effettuato il giorno successivo a partire dallo striscio che nel frattempo è stato fatto crescere in stufa. CRACKING BUFFER 2X (10ml): NaOH 2M 0.5 ml EDTA 0.5 M 0.2 ml SDS 10% 1 ml Glicerolo 1ml Acqua 7.3 ml Green 0.005 g (una punta di spatola) |
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