Utilizzare questo metodo in Real Time per amplificati non superiori ai 200bp, a causa dell’instabilità dell’amplificato stesso oltre le 200bp.

Allestire una reazione di PCR semiquantitativa + H2O (naturalmente) con un volume finale di 50 o 75μl ( perché nella purificazione il volume è da 50 a 100μl ), mettendo il campione concentrato da 10 a 20 ng totali, primers alla concentrazione solitamente utilizzata ( noi utilizziamo 15 μM) e spingendo la PCR a 40 o 45 cicli.

Metodo A
Controllare eventuali aspecifici, correndo un’aliquota di amplificato in gel d’agarosio.
Purificare l’amplificato con le colonnine della INVITROGEN : Pure LinkTM PCR Purification Kit. Seguire il protocollo del Kit utilizzando il binding buffer appropriato a seconda della grandezza dei miei frammenti.

Metodo B
Fare un gel d’agarosio,con il pettine a denti larghi, unendo due denti con lo scotch, in modo da formarne uno solo. Seminare tutto l’amplificato, farlo correre con il ladder usando le giuste proporzioni di colorante ( posso in questa fase vedere eventuali aspecifici) e vedere se l’amplificato è della giusta banda .
Mettere il gel al transilluminatore e tagliare la banda d’interesse.
Con questo metodo taglio solo la banda d’interesse ed eventuali aspecifici vengono eliminati.
Fare una purificazione da gel mediante colonnine della INVITROGEN: Pure LinkTM Quick Gel Exraction Kit.

Al termine di entrambi i metodi ho un amplificato purificato che devo quantificare.
Fare una lettura allo Spettrofotometro del cDNA, utilizzando come blank l’elution buffer e leggendo come DNA.
Calcolare la quantità mediante la seguente formula.

(6.03x1023x 5x10-5g/ml)x λ260
________________________ = n°COPIE /ml
Bp di prodotto x (6.58x102 g)



Posso così semplificare: 4.57x1016 x λ260
_______________ = n°COPIE /ml Dividendo per 1000=/ul
Bp prodotto

Un’ altra formula è la seguente:

µg DNA x (pmol/ 660pg) x (106pg/ 1µg) x (1/#nucleotides) = pmol DNA

Aliquotare l’ amplificato purificato alla concentrazione di 10^8, e conservare le aliquote a -20°C.
Preparare una curva standard partendo dal concentrato (10^8), ogni qualvolta si allestisce una curva standard. Evitare congelamenti e scongelamenti delle diluizioni.

Al momento di allestire una curva standard si diluisce l’amplificato 10^8 ( C.in. x V.in. = C.fin. x V.fin.) serialmente in aliquote concentrate : 10^7,10^6, 10^5, 10^4, 10^3,10^2 copie/ul.

PROTOCOLLO DI REAL TIME DA AMPLIFICATO PURIFICATO

Nella stanza pre PCR preparare la MIX per la reazione di real time, dispensarla in tutti i pozzetti quindi dispensare prima l’H2O eppoi i campioni, meglio lavorare con tubini o streep invece della piastra per evitare contaminazioni nell’aprire e chiudere i tubi, se proprio bisogna usare una piastra chiudere prima di andare in stanza post PCR i pozzetti dei campioni/ h2o con i tappini in senso verticale. Portare le streep contenenti la Mix per la curva standard nella stanza post PCR e solo lì dispensare l’amplificato purificato cominciando dal meno concentrato ( facendo la piastra:tappare la fila della curva standard quindi mettere su tutta la piastra una pellicola adesiva per le piastre ). Nel caso si volesse essere certi che anche in questa fase non siano avvenute contaminazioni si possono inserire all’inizio o alla fine della curva delle H2O.

Ricordarsi di cambiare i guanti ogni volta che si apre un tubo di amplificato, visto che la maggior parte delle contaminazioni avviene per questo motivo.
Non avvinare il puntale.
Usare un set di pipette dedicate agli amplificati.
Cambiarsi il camice.

PROTOCOLLO 1X MIX per REAL TIME con SYBER

10ul di SYBER GREEN +
5ul di PRIMERS F/R 300nM
___________________
15ul MIX + 5ul di CAMPIONE [2ng/ul] oppure

+ 5ul di STANDARD [10^2-->10^7] oppure 4μl di H2O + 1 μl di amplificato [10^2-->10^7]