- Bisogna prima di tutto preparare delle piastre chamber-slide da 8 pozzetti: aggiungendo 20 µg/ml di Poly-D-Lysina (Sigma) in soluzione acquosa per 1 ora a 37°C, lavandole poi tre volte con acqua sterile prima dell’uso.

- Si prepara poi il terreno di coltura per il differenziamento costituito da:

° Neurobasal,
° B27 50X,
° L-Glutammina 1%,
° Penicillina/streptomicina 1%
° βFGF 20ng/ml.

- Le cellule staminali ottenute dalla dissociazione delle neurosfere vengono dunque sospese in 350 µl di questo terreno di differenziamento.

- Da questa sospensione si fa una diluizione 1:5 con Trypan Blue allo 0.4% per poter proseguire con la conta cellulare.

- Si seminano circa 50.000 nelle rispettive chamber slide precedentemente trattate e si incuba overnight.

- Le cellule seminate emettono dei prolungamenti ed aderiscono al substrato.

- Si preparano tre serie di pozzetti in ognuno delle quali porremo terreno fresco, contenente tre differenti fattori trofici per poter raggiungere un diverso grado differenziativo:

° PDGF 0.01%;
° CTNF 0.01%;
° T3 0.01%.

- Si incuba per sette giorni. Successivamente, si elimina il terreno e si aggiunge PBS 1X per lavaggio.

- Dopodiché le cellule vengono fissate con metanolo ed acetone a -20°C.

- Dopo ulteriori lavaggi con PBS 1X a temperatura ambiente, si procede con la permiabilizzazione utilizzando PBS 1X con 0.2% Triton per 30 minuti a temperatura ambiente.

- Si lava con PBS e si può poi passare alla saturazione incubando con FCS 2% in PBS1X per 30 minuti a temperatura ambiente.

- Dopo aver eliminato il buffer di saturazione si effettua quindi un’incubazione over-night con anticorpi primari a 4°C per seguire specifici markers e capire se il differenziamento ha avuto buon esito.