Purificazione dei corpi elementari delle clamidie
Il ceppo di clamidie cresciuto nei monostrati cellulari dei tubini, è stato passato da questi nei monostrati cellulari di 30 piastre a 6 pozzetti del diametro di 3,5 cm, centrifugato a 2000 rpm per 2 ore a 33°C e successivamente posto ad incubare a 37°C per 48-72 ore. Successivamente, i CE delle clamidie sono stati purificati usando gradienti di saccarosio seguendo la metodica di Tamura e Higashi (Tamura A. et al., 1963)46 con alcune modifiche (Fukushi e Hirai, 1988)47. Le cellule infettate con le clamidie, sono state staccate con rubber, raccolte in provette coniche da 50 ml e sottoposte a sonicazione per 3 cicli di 10 secondi ciascuno, con un sonicatore Bandelin alla minima potenza e quindi centrifugate a 3000 rpm per 10 minuti a 4°C; il sovranatante, contenente le clamidie, è stato ultracentrifugato a 18000 rpm per 35 minuti a 4°C con il rotore SW27 per ultracentrifuga Beckman. Successivamente, il pellet è stato sospeso in 40 ml di TRIS 0.01M pH 7.4, sonicato 3 volte per 10 secondi e suddiviso in due provette contenenti un cuscino di saccarosio al 30% (peso/peso)in TRIS 0.01M pH 7.4. In seguito ad ultracentrifugazione a 18000 rpm per 45 minuti a 4°C, il pellet di ciascuna delle due provette è stato sospeso in 2 ml di TRIS, sonicato 2 volte per 10 secondi e stratificato con pipetta Pasteur su un gradiente continuo di saccarosio 30-60% (peso/peso). Dopo centrifugazione a 18000 rpm per 1 ora a 4°C, la banda dei CE, presente a circa metà altezza di ciascuna delle due provette, è stata raccolta con siringa con ago lungo 8 cm e risospesa in TRIS. Il pellet ottenuto dopo centrifugazione a 18000 rpm per 35 minuti e contenente i CE purificati delle clamidie, è stato sospeso in circa 300 µl di saccarosio-fosfato- acido glutammico (SPG) 0.2M e congelato fino al momento dell’uso a -70°C, dopo la sua ripartizione in piccole aliquote.