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Preparazione Batteri Competenti Descrizione La competenza si ottiene modificando alcune proprietà chimico fisiche delle membrane cellulari con l’impiego di scariche ad alto voltaggio (elettroporazione) oppure, in una fase precisa della crescita esponenziale, di sostanze chimiche quali CaCl2. I cationi bivalenti schermano le cariche negative sul DNA e sulla cellula, e facilitano l’ingresso del DNA, riorganizzando i lipopolisaccaridi lontano dai canali di membrana. Il calore, poi, sotto forma di shock termico durante il processo di trasformazione, esalta l’azione degli ioni calcio, facilitando l’ingresso del plasmide. In questo modo alcune cellule potranno inglobare i plasmidi. L’efficienza di trasformazione ottenibile in laboratorio varia a seconda del metodo eseguito e del ceppo batterico utilizzato. In generale con cellule di E.coli, rese competenti con CaCl2, si ottengono efficienze di 108 cellule trasformate per µg di DNA plasmidico. Il mantenimento della temperatura a 4°C è fondamentale per una buona preparazione di batteri competenti quindi TENERE I BATTERI SEMPRE IN GHIACCIO A 4°C. 1- Piastrare i batteri competenti (congelati in glicerolo a -80°C) con un’ansa su una piastra di agar NON contenente ampicillina o altri antibiotici normalmente utilizzati come agente di selezione, sotto l’apposita cappa. 2- Lasciar crescere i batteri overnight a 37°C mettendo la piastra capovolta . 3- Con la punta di un puntale inoculare una delle colonie cresciute in 2 ml di LB o SOB e porre in agitazione a 37°C a 225 rpm overnight. 4- La mattina seguente versare la coltura di 2ml in una beuta contenente 100 ml di LB e lasciarli crescere fino a che non raggiungono OD600= 0.5-0.6 5- Mettere la beuta in ghiaccio per 10 minuti in modo da raffreddare la coltura batterica. 6- Centrifugare a 3000 rpm per 20 min a 4°C. 7- Decantare e risospendere il pellet in 50 ml CaCl2 mM freddo. 8- Lasciare 20 minuti in ghiaccio. 9- Centrifugare nuovamente a 3000rpm per 20 min a 4°C. 10- Risospendere il pellet in 1,5 ml di CaCl2 50mM + glicerolo 15% (freddo) o in un volume più piccolo se si vogliono molto concentrati. 11- Aliquotare i batteri in Eppendorf (40microl) e preferibilmente congelarli rapidamente in azoto liquido e poi metterli a -80°C. 12- Per verificare l’efficienza di trasformazione dei batteri, eseguire una trasformazione con un plasmide noto. |
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