Genotipizzazione di topi transgenici
Descrizione
Questa tecnica permette la determinazione del genotipo di topi transgenici tramite analisi di biopsia della coda. La tecnica può ovviamente essere applicata anche alla genotipizzazione di altri animali.
Rimuovere la punta (circa 5mm, a seconda delle regolazioni locali) della coda e metterla in una provetta da 1.5mlAggiungere 0.7ml di buffer di lisi e proteinasi K (100 µg/ml) e digerire per almeno 4 ore (o overnight) a 55ºC, sotto agitazione (~600rpm).Invertire le provette per miscelare bene il contenuto.
Eventualmente continuare la digestione fino a che tutto il tessuto sia stato digerito (nota: il pelo non verrà digerito)Centrifugare per 10' alla massima velocità a temperatura ambienteTrasferire il surnatante in una provetta contenente 0.7ml di isopropanolo.Miscelare per inversioneConsiglio
Conviene miscelare i campioni tutti insieme dopo aver trasferito tutti i surnatanti, per evitare di avere precipitati proteici nei campioni che sono stati per molto tempo in isopropanolo.
Centrifugare 5' alla massima velocità a temperatura ambienteRisospendere i campioni in 0.8 ml di TE (se la resa in DNA è bassa si può diminuire la quantità di TE)Dissolvere il DNA incubando per non più di 1 ora a 55ºC o (meglio) a 4ºC overnight.Vortexare i campioni per assicurarsi che il DNA sia in soluzione e centrifugare velocemente.Procedere con una normale PCR usando primer e condizioni adatte a visualizzare il gene di interesse.
