1. Omogenare i singoli campioni con l’ausilio di palle e giare in acciaio di 10 mL per l’omogeneizzatore Tissue Lyzer (Qiagen)

2. Sotto cappa chimica preparare all’ultimo momento 7 ml per grammo di campione (nervature) di tampone CTAB 3% con 0,2% di 2-mercaptoetanolo (14 µlitri di 2-mercaptoetanolo in 7 ml di CTAB).

3. Aggiungere 7 ml di tale soluzione a ciascun campione nel mortaio. Tale operazione deve avvenire sotto cappa chimica.

4. Omogeneizzare bene i campioni e, utilizzando una micropipetta sterile pasteur monouso oppure con puntali da 1000 µlitri tagliati alla punta, trasferire 1 ml di ciascun campione in eppendorf da 2 ml.

5. Incubare a 65 °C per 20 minuti (oppure a 60 °C per 1 ora) nel Thermomixer con agitazione a 1400 rpm ogni 5 minuti

6. Sotto cappa chimica aggiungere 1 ml di cloroformio ad ogni campione (per ogni eppendorf) e mescolare bene per inversione (oppure con vortex per 20”).
- Centrifugare a 11000 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferire il sopranatante in nuove eppendorf da 2 ml, precedentemente numerate ed identificate, (preraffreddate).
- Aggiungere 1 ml di isopropanolo (conservato a –20°C) ed agitare bene per inversione.
- Mettere i campioni (eppendorf) in un rack e lasciarli per 5 minuti a –20°C.
- Centrifugare a 11000 g per 15 minuti a 4°C.
- Gettare l’isopropanolo scolandolo lentamente e facendo attenzione a non perdere il pellet originatosi in seguito alle centrifughe precedenti.
- Aggiungere al pellet 350 µlitri di NaCl 1,2 M e 350 µlitri di cloroformio, agitando bene per inversione fino a risospendere il pellet (staccarlo). In alternativa si può utilizzare il vortex (forse più efficace).
- Centrifugare a 11500 g per 10 minuti a + 4°C.
- Trasferire il sopranatante in eppendorf nuovi da 2,0 mL ed aggiungere 0,6 volumi di isopropanolo (ad esempio 300 µlitri x 0,6 = 180 µlitri). Agitare a culla per riprecipitare il DNA.
- Centrifugare a 11500 g per 10 minuti a + 4°C.
- Aggiungere 500 µlitri di etanolo al 70% (conservato a –20°C), alla soluzione preesistente (NaCl 1,2 M, cloroformio, isopropanolo), ed agitare a culla (o utilizzare il Vortex) fino a staccare il pellet originatosi dalle operazioni precedenti.
- Centrifugare a 11500 g per 10 minuti a 4°C.
- Gettare la soluzione acquosa scolando lentamente e facendo attenzione a non perdere il pellet originatosi in seguito alle centrifughe precedenti.
- effettuare un secondo lavaggio (se ritenuto necessario) con Etanolo al 70%
- Asciugare con lo speed vacuum per 5 minuti.
- Aggiungere 80-100 µlitri di tampone TE (pH 7,6) e lasciare in frigo a +4°C tutta la notte in modo che il DNA si risospenda nel tampone. In alternativa si possono incubare i tubi da 2.0 mL nel Thermomixer a 65°C per 10 minuti, in modo tale da sciogliere il pellet e permettere al DNA di entrare nella soluzione.