Preparare la necessaria quantità dei seguenti terreni:
- Half Fraser Broth
- Fraser Broth
- ALOA Agar
- Oxford Agar
- Sheep Blood Agar
- TSYEA
- TSYEB
seguendo le indicazioni fornite dai produttori.
Prelevare asetticamente 25 gr del campione, diluirlo in rapporto 1:10 con 225 ml di terreno Half Fraser Broth (o altro diluente se diversamente indicato nelle ISO 6887-2:2003; ISO 6887-4:2003; ISO 8261:2001 e seguire le indicazioni in esse fornite per la preparazione del campione), per eseguire un primo arricchimento. Omogeneizzare in APP36. per meglio miscelare il campione.
Indicare sul fondo di ogni piastra o su ogni provetta il numero del campione e la rispettiva diluizione, se il caso indicare con una sigla il terreno e almeno su una piastra o provetta per parametro l’ora di inizio dell’incubazione.
Chiudere il sacchetto e porlo ad incubare a 30° C per (18±2)h.
Dopo l’incubazione della sospensione iniziale (primo arricchimento), trasferire 0,1 ml della brodocoltura in 10 ml di Fraser Broth (secondo arricchimento) ed incubare a (36±1)°C per (48±2)h.
Dal primo arricchimento prelevo, mediante ansa sterile, una porzione della coltura e la inoculo sulla superficie del primo terreno solido selettivo in piastra (Oxford Agar). Procedo alla stessa maniera con il secondo terreno solido selettivo in piastra (ALOA). Dal secondo brodo di arricchimento ripeto la procedura appena descritta sui due terreni selettivi (Oxford e ALOA) in piastra.
Incubare le piastre invertite a (36±1)° C per (24±3)h. Dopo 24 ore controllare la crescita sui terreni: se non sono osservabili colonie o la crescita è bassa, si può prolungare l’incubazione per altre 18-24 h.
Dopo 24h su Oxford Agar le colonie sospette di Listeria spp. sono piccole (1 mm), grigie e con alone scuro. Dopo 48 ore di incubazione le colonie diventano più scure e grandi (2mm), concave e con alone nero.
Su ALOA le colonie sospette di Listeria spp. presentano colore blu-verde con un alone opaco.
Nel caso si individui colonia/e sospetta/e si deve procedere ad una identificazione biochimica per accertare l’appartenenza al genere Listeria.

Prelevare 5 colonie sospette da ciascuna piastra di ciascun terreno. Se su una piastra ce ne sono meno di cinque, confermarle tutte; subcoltivarle su TSYEA ed incubare a (36±1)°C per 24 h o comunque fino ad avere una crescita soddisfacente.
Le colonie tipiche hanno un diametro di 1-2 mm, sono convesse, incolori ed opache con bordo non frastagliato.
Dalla coltura su TSYEA eseguire i seguenti test:

• prova della catalasi
Porre su un vetrino per microscopia una goccia di perossido d’idrogeno al 3% in cui sospendere una colonia prelevata dalla piastra di TSYEA. L’immediata formazione di bolle indica reazione positiva.
• prova della colorazione di Gram
Colorare con kit dedicato una colonia prelevata dalla piastra di TSYEA. Listeria spp. è Gram positivo (blu o viola), a forma di bastoncello lungo e stretto.
• prova della motilità
Sospendere una colonia in una provetta contenente TSYEB Incubare a 25° C per 8-24h, fino ad osservare l’intorbidimento del terreno. Prelevare una goccia del brodo e porla su un vetrino con copri-oggetto ed osservarla al microscopio: Listeria spp. appare come un bastoncello corto e sottile con miovimento rototraslatorio.
Prestare attenzione: cocci, bastoncelli larghi o bastoncelli con movimento rapido non sono da considerarsi Listeria spp.
• prova dell’emolisi
Se i due test precedenti hanno evidenziato presenza di Listeria spp., procedere con inseminazione delle colonie in Blood Agar Base 2.
Dedicare uno spazio per ogni coltura e simultaneamente piastrare un controllo positivo (L. monocytogenes) ed uno negativo (L. innocua). Incubare a (36±1)° C per (24±2)h.
Esaminare le colture di controllo: L. monocytogenes presenta una sottile zona chiara (β-emolisi). L. innocua non presenta zone chiare. L. ivanovii presenta un’ampia zona chiara attorno allo striscio.
• prova dell’utilizzo dei carboidrati
Dal TSYEB inoculare un'ansata nel brodo di ramnosio e xilosio. Incubare a (36±1)° C fino a 5 giorni. La formazione di acido indicata dalla colorazione gialla è da considerarsi positiva e avviene tra le 24 e le 48 h.
• prova di identificazione biochimica
Questo test viene condotto utilizzando kit miniaturizzati.
• CAMP test
Su una singola piastra di Blood Agar base 2 piastrare in parallelo le colture di S. aureus, R. equi, L. monocytogenes L. ivanovii e L. innocua, assieme al campione da testare.