Test sulla catalasi epatica
Descrizione
Un semplice protocollo per verificare la presenza della catalasi in un campione di fegato bovino e studiare la sua funzione e se essa si modifica con l’intervento di calore e variazione di pH.
Materiali e attrezzature:
- Provette da batteriologia.
- Portaprovette.
- Bisturi.
- Becher.
- Matraccio da 500 ml.
- Bagnomaria.
- Spatola.
- Bacchetta di vetro.
- Vetrino a orologio.
- Bilancia digitale (S: 0,01 g P:500 g).
- Fegato di bovino.
- HCl al 37% v/v (corrosivo, tossico per inalazione)
- Idrossido di sodio in pastiglie
- Blu di metilene (Nocivo, irritante).Procedimento operativo: Il procedimento richiede l’utilizzo di idrossido di sodio, per alcuni dei saggi sulla reattività dell’enzima in ambiente alcalino.
Per tale motivo, se ne prepara una soluzione 1 M da 500 ml:
a) Si prelevano 20 g di NaOH solido dal suo contenitore mediante bilancia digitale.b) Si discioglie il solido in un volume di acqua inferiore a quello prefissato per la soluzione.c) Si mescola con una bacchetta di vetro pulita fino alla completa dissoluzione del soluto.d) Si attende che la temperatura cali (la dissoluzione è esotermica).e) Si travasa in un matraccio da 500 ml e si porta a volume con H2O distillata.f) Si tappa il matraccio, si capovolge per omogenizzare la soluzione e si riappoggia sul bancone.g) Infine, si scrivono le informazioni riguardanti contenuto, operatore e data di preparazione della soluzione sul vetro con un pennarello. Preparata la soluzione, si procede con i preparativi dell’esperienza effettiva:
a) Si preleva una porzione più piccola di fegato dall’organo intero.b) Si pone tale porzione su un foglio di plastica (in modo da non sporcare il bancone).c) A partire dalla porzione prelevata, si sezionano in maniera fine delle strisce di tessuto epatico, in modo da ottenerne 7 porzioni di dimensioni simili. L’esperienza si divide in 2 parti distinte:
a) Analisi in ambiente neutro.
b) Analisi in ambienti acido e alcalino. PASSAGGIO IMPORTANTE
Analisi in ambiente neutro.a) Si preparano 6 provette e le si pone in un porta-provette.
i. Nelle prime 2 si pone solo il fegato.
ii. Nelle successive 2 fegato e una goccia d’indicatore (blu di metilene).c. Nelle ultime 2 si versa H2O distillata per 1/3 del volume totale. (Queste ultime saranno impiegate per testare la purezza dell’H2O2.)b) Si dividono quindi le 6 provette in due gruppi da 3. Nelle prime tre si lavorerà a freddo. Nelle altre 3 si lavorerà a caldo (tra i 90 e i 100 °C) e per tale motivo le si pone in termostato mentre si lavora sulle altre.c) Il procedimento, sia a caldo che a freddo, è lo stesso:
d) Si pongono alcuni ml di H2O2 nella provetta (sia che contenga fegato sia che contenga H2O) e si annotano le relative osservazioni. PASSAGGIO IMPORTANTE
Analisi in ambienti acido e alcalino. a) Si lavano 2 delle provette precedentemente impiegate e vi si pongono 2 delle restanti 3 porzioni di fegato. Quindi si procede in maniera differente per ognuna delle 2.
i. Nella prima provetta si aggiunge 1 ml di HCl al 37% v/v mediante una pipetta e lavorando sotto cappa, data l’emissione di vapori corrosivi dal contenitore.
ii. Nella seconda provetta si aggiunge NaOH 1M fino a riempire 1/3 della provetta.b) Si procede ad aggiungere in ognuna delle 2 provette una quantità uguale di H2O2 e si annotano le relative osservazioni.c) Si ripete la prova in ambiente alcalino utilizzando l’ultima porzione di fegato rimasta, con la stessa procedura indicata sopra, ma lavorando a caldo.d) Si annotano le osservazioni relative anche a questa prova.
