Protocollo

PCR

Descrizione

Un generico protocollo per PCR (polymerase chain reaction).
La PCR permette di amplificare una sequenza di DNA compresa fra due brevi sequenze per cui si costruiscono oligonucleotidi, detti primers.

Unire i seguenti componenti in un mix (lavorare in ghiaccio)

Per ogni campione :

2.5 µl Buffer PCR 10X (senza Mg++)
0.75 µl MgCl2 50mM
0.5 µl dNTPs 10mM
1 µl del mix dei due primer a 25 pmol/µl ciascuno. (questo può variare a seconda del gene target)
0.125 µl Taq (5U/µl)
18.125 µl acqua milliQ sterile

Per un totale di 25µl a campione (se la PCR è preparativa si vorranno scalare questi valori in modo da ottenere un volume finale maggiore).

Consiglio

Può essere utile considerare 1 campione in più ogni 10/15 per compensare eventuali piccoli errori nel pipettamento.

Consiglio

Conviene mettere la Taq come ultimo reagente e tirarla fuori dal frigorifero solo prima dell'uso (come in generale tutti gli enzimi).

Dispensare 23µl della mix in provette da PCR.

Aggiungere 2µl del DNA da amplificare. La quantità da aggiungere ovviamente varia a seconda del gene da amplificare.

ATTENZIONE: se la PCR è semiquantitativa i campioni di DNA vanno prima dosati (con lettura a 260 nm allo spettrofotometro) e diluiti tutti alla stessa concentrazione. Questo passaggio non è necessario per PCR solo qualitative.

Inserire le provette nel termociclatore usando un ciclo appropriato per il gene di interesse.

Un ciclo generico può essere:

2' a 95ºC

35-40 cicli di:
30" a 95º
45" alla temperatura di annealing dei primers (55-60º)
1'30" a 72º

10' a 72º
4º fino all'utilizzo

Creare un gel di agarosio per visualizzare i prodotti.

Dissolvere 0.5-2% (dipendentemente dalla lughezza del prodotto) di agarosio in TAE o TBE.

Mettere nel microonde per circa 1-2 minuti o fino a che la soluzione non diventa trasparente.

PASSAGGIO IMPORTANTE

Aggiungere circa 7 µl di EtBr per 50ml di agarosio.
ATTENZIONE: i vapori di EtBr sono molto tossici. Lasciare raffreddare brevemente la soluzione di agarosio prima di aggiungere EtBr, ed evitare comunque di respirarne i vapori. Lavorare sempre con i guanti.

Versare l'agarosio nel gel-caster, mettere il pettine e aspettare che il gel si sia solidificato.

Aggiungere 3µl di PCR loading buffer al campione e caricare i campioni sul gel.

Visualizzare il risultato al transilluminatore UV.