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alessandro.gori
Nuovo Arrivato



10 Messaggi
Inserito il - 30 marzo 2023 : 15:19:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di alessandro.gori Invia a alessandro.gori un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hi to everybody, I have a problem with a transformation experiment:

I'm trying to clone a gene in E. coli BL21(DE3).
The gene was from pseudomonas and successfully cloned in pJET1.2/blunt.
After ligation of the gene in expression plasmid pET 24a or pET 29a and trasformation in BL21(DE3) and kanamicin selection I have several colonies. When I try to search for the construct inside the cells (colony PCR with T7 promoter and T7 terminator primers) I have no positive colony. In the same PCR I process also the ligation (gene to be expressed and pET expression plasmid after ligation) and is positive (amplification to expected size). Why I have no positive colony after transformation? I have tried to transform other hosts like JM109, DH10B and I have the same results : no positive colony. I have checked for antibiotic resistence of the strains before transformation and all the strains used are Kanamicin sensible. I have tried to extract plasmid DNA from the colonies but I have no plasmid inside too!. Is possible that the gene is a lethal gene for E. coli? Why I have colonies on selective medium? Any suggestion is welcome!

Patrizio
Moderatore

mago

Cittā: Barcellona


1912 Messaggi
Inserito il - 31 marzo 2023 : 21:02:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Alessandro,
perche' scrivi in inglese?
puoi anche scrivere in Italiano :)

mi scrivi il tuo procollo di clonaggio?
cmq se crescono i batteri almeno il plasmide "vuoto"dovresti averlo altrimenti non avrebbero resistenza

best

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alessandro.gori
Nuovo Arrivato



10 Messaggi
Inserito il - 03 aprile 2023 : 16:02:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di alessandro.gori Invia a alessandro.gori un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve Patrizio,
il protocollo č quello classico : taglio con gli enzimi di restrizione sia del plasmide con il gene clonato che di pET. Purificazione su agarosio ed estrazione delle bande tagliate con kit Gel extraction thermofisher. controllo su agarosio delle bande . Ligazione con T4 ligasi seguendo protocollo Thermofisher. Trasformazione in BL21(DE3)cellule chimicamente competenti selezione su kanamicina. Le colonie ottenute vengono sottoposte a colony PCr con primers T7 promoter e terminator . Faccio anche estrazione pDNA con kit thermofisher miniprep . Nessuna colonia presenta amplificato nč pDNA.
Ho escluso che si tratti di riconbinazione con il genoma di coli perchč quando faccio PCr con i primers con cui ho clonato il gene non ho amplificato. Anche io pensavo che almeno il plasmide vuoto doveva esserci ma non č cosė. Alcuni mi hanno suggerito che č possibile avere dei mutanti spontanei e quindi privi di plasmide. Ho testato le cellule competenti per la resistenza all'antibiotico e non ottengo colonie dopo la semina su LB + Kanamicina. I reagenti sono tutti ok nuovi e funzionano quando ho fatto la ligazione in pJET1.2/blunt e anche il kit di estrazione del pDNa funziona perchč ottengo molto facilmente il plasmide riconbinante pJET1.2/blunt con il mio gene legato oppure il PET 29a o 24a che hanno come ospite JM109. Quando faccio PCR su ligazione gene + PET29a o 24a con T7 promoter e terminator ottengo la banda all'altezza aspettata e la inserisco sempre come controllo positivo nella colony PCR.
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Patrizio
Moderatore

mago

Cittā: Barcellona


1912 Messaggi
Inserito il - 18 aprile 2023 : 15:24:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
strano, probabilmente non hai tanto plasmide clonato. Di certo se la PCR sul ligato ti viene vuol dire che hai clonato su questo non ci sono dubbi, forse dovresti provare a aumentare il numero di colonie per la colony PCR?
e' un clonaggio direzionale? se e' direzionale e usi 2 enzimi diversi il plasmide non si richiudera' e non potrai avere colonie negative, se le hai vuol dire che non stai digerendo abbastanza il plasmide.
Se non e' un clonaggio direzionale usa la fosfatasi alcalina dopo il taglio con l'enzima per evitare che il plasmide si richiuda su se stesso.

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